结直肠癌组织中KRAS、NRAS及BRAF基因突变状态与临床病理特征的关系

孙耀华，汪润秋，赵 静，李雪莹，杨慧玲，白辰光

海军军医大学第一附属医院病理科 上海 200433

结直肠癌是常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤[1]。在我国，结直肠癌的发病率和病死率分别位居恶性肿瘤的第三位和第五位[2]，且其发病率和病死率呈逐年上升趋势[3]。尽管手术方式、放化疗方案、以及靶向治疗药物得到了不断改进，但晚期结直肠癌的预后仍不乐观。

KRAS、NRAS、BRAF基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)依赖的下游信号转导通路RAS-RAF-MAPK中的3个重要基因，这些基因突变后会导致下游信号通路的持续激活，引起细胞发生不依赖于表皮生长因子刺激的异常增殖，最终导致肿瘤的发生和持续进展。2018年版《结直肠癌分子生物标志物检测专家共识》[4]推荐，对临床确诊的复发或转移性结直肠癌，应进行RAS(包括KRAS和NRAS)和BRAF基因检测，以对预后进行分层，指导临床治疗。虽然国内有一些关于KRAS、NRAS和BRAF基因在结直肠癌组织中突变情况的报道，但是由于样本量的限制和病例筛选的差异，研究结果有所不同，特别是来自单中心大样本的病例研究较少。本研究采用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)检测了单中心1 205例结直肠癌根治患者癌组织中KRAS、NRAS、BRAF基因的突变状态，探讨其与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系。

1 对象与方法

1.1临床资料收集海军军医大学第一附属医院2015年5月至2016年4月共计1 205例资料完整、病理诊断明确的结直肠癌标本。研究通过该院医学伦理委员会的审核批准。1 205例结直肠癌患者年龄15～88岁，<40岁88例，40～岁663例，≥60岁454例；男722例，女483例，男女比为1.49:1。原发部位为右半结肠244例，左半结肠300例，直肠661例；1 029例诊断为普通型腺癌，176例为黏液腺癌；132例为低分化腺癌，1 073例为高/中分化腺癌；肿瘤最大径<4 cm者498例，≥4 cm者707例；510例检出区域淋巴结转移；pTNM分期Ⅰ期212例，Ⅱ期439例，Ⅲ/Ⅳ期554例。

1.2结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测

1.2.1 标本处理 所有标本离体后立即用中性福尔马林溶液固定，规范取材后，于全自动脱水机(LEICA ASP300S)中梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色。由两位病理医师阅片，标识出肿瘤丰富的区域(区域内肿瘤细胞比例>40%，且保证含有200～400个肿瘤细胞)。尽量选取以肿瘤细胞为主，没有明显坏死、黏液和炎性改变的组织进行基因检测，以提高检测的准确性。

1.2.2 DNA提取 将经过病理医师标识的蜡块10 μm连续切片5张并黏附于载玻片上，烤片后经梯度乙醇脱蜡至水，小心转移至1.5 mL离心管中。DNA提取严格按照厦门艾德生物有限公司的说明书操作，用紫外分光光度计(美林恒通SMA4000)测量所提DNA的质量和纯度。

1.2.3 基因突变检测 采用ARMS和实时荧光定量PCR技术，应用厦门艾德生物有限公司生产的人类KRAS/NRAS/BRAF基因突变联合检测试剂盒(货号ADx-KN04-MX)，检测标本DNA中KRAS基因第 2、3、4 号外显子，NRAS基因第2和第3号外显子，BRAF基因第15号外显子的热点突变。试剂盒可检测位点见表1。标本 DNA的稀释、配置、加样、反应循环参数及结果判读均严格按照试剂盒说明书进行。每次反应均设定各种突变的阳性及阴性对照。PCR仪为美国Stratagene公司的Mx3000P。

表1 KRAS/NRAS/BRAF基因突变联合检测试剂盒可检测位点

1.3统计学处理采用SPSS17.0进行数据处理。采用χ2检验或精确概率法比较不同临床病理特征的结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF基因突变状态，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF基因的突变状态1 205例中，KRAS基因突变检出率为44.6%(538/1 205)，其中95.9%(516/538)为第2外显子第12、13密码子突变。NRAS基因突变检出率为2.7%(33/1 205)，其中93.9%(31/33)为第2外显子第12、13密码子突变。BRAF基因突变检出率为3.2%(38/1 205)，均为V600E。未发现KRAS、NRAS、BRAF基因之间存在有交叉突变。

2.2结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF基因的突变状态与临床病理特征的关系见表2。①KRAS：黏液腺癌组织中KRAS基因突变检出率明显高于普通型腺癌；高/中分化癌组织中检出率高于低分化癌组织;女性患者检出率高于男性;原发于右半结肠的癌组织中KRAS基因突变检出率略高于原发于直肠的癌组织，原发于左半结肠的癌组织中检出率最低(P<0.05)。②NRAS：不同性别、年龄、原发部位、组织学类型、分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移状态和pTNM分期的癌组织中KRAS基因突变检出率差异均无统计学意义(P>0.05)；在<40岁的患者中未检出NRAS基因突变。③BRAF：原发于右半结肠、黏液腺癌、低分化、肿瘤最大径≥4 cm、有淋巴结转移、pTNM分期Ⅲ/Ⅳ期的癌组织中BRAF基因突变检出率明显更高(P<0.05)。

表2 不同临床病理特征结直肠癌组织中KRAS、NRAS及BRAF基因突变分析

3 讨论

2018年版《结直肠癌分子生物标志物检测专家共识》[4]推荐:对临床确诊为复发或转移性结直肠癌，应进行KRAS、NRAS和BRAF基因检测;RAS基因突变分析应包括KRAS和NRAS基因2号外显子、3号外显子以及4号外显子;BRAF V600E基因状态的评估应在RAS检测时同步进行。

相关研究[5]结果显示，KRAS基因在结直肠癌患者中的突变率为20%～50%。本研究中结直肠癌组织中KRAS基因突变检出率为44.6%(538/1 205)，与文献报道相近；黏液腺癌组织中KRAS基因突变检出率高于普通型腺癌，高/中分化癌组织中检出率高于低分化癌组织，提示KRAS基因突变可能与结直肠癌的恶性进展有关。有文献[6]报道，KRAS基因突变与结直肠癌pTNM分期关系密切；但本研究中未发现该突变与pTNM分期有关，也有一些报道[7-8]与本研究结果相似。我们认为，在许多结直肠腺瘤组织中也可检出KRAS基因突变，说明KRAS基因突变在肿瘤发生的早期就已出现，其与反映肿瘤进展的pTNM分期的关系还不明确。本研究结果还显示女性患者KRAS基因突变检出率高于男性，刘珊等[9]的研究结果也有类似发现，但多数研究认为KRAS基因突变与性别无关。

NRAS基因是RAS基因家族中的一员， 其突变状态对于结直肠癌靶向药物的治疗效果具有重要意义。本研究中，结直肠癌组织中NRAS基因突变检出率为2.7%(33/1 205)，与de Roock等[10]结果近似。本研究未发现NRAS基因突变与结直肠癌的临床病理特征有关，但40岁以下的患者中未检出NRAS突变，检出NRAS突变的病例最小年龄是46岁；原发于直肠的癌组织中NRAS基因突变检出率较高。我们推测患者年龄、原发部位可能与NRAS基因突变有一定关联，有待扩大病例数进一步分析证实。

BRAF基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控如细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，该基因突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床预后有关。BRAF基因与RAS基因虽然同处于RAS-RAF-MAPK通路，但它们相互排斥，即如果肿瘤存在RAS基因突变，那么就不会同时发生BRAF基因突变，反之亦然，但这并不意味着BRAF和RAS检测只需选择其中之一。有研究[4]发现EGFR单抗(西妥昔单抗和帕尼单抗)对存在BRAF基因V600E突变的患者治疗无效，所以建议BRAF V600E基因状态的评估应在RAS检测时同步进行，以指导临床进行个体化的精准治疗。本研究中，结直肠癌组织中BRAF突变检出率仅为3.2%(38/1 205)，略低于国内外的报道(4%～10%)[11-13]，可能与本组病例中原发部位为直肠和左半结肠的患者比例较高(接近80%)有关。BRAF基因突变与多种不良预后相关临床病理特征关系密切。在原发部位方面，右半结肠癌组织中BRAF突变检出率达6.1%(15/244)，与Chen等[14]的结果相似；在组织学类型方面，黏液腺癌BRAF突变检出率达6.3%(11/176)，高于普通型腺癌；在分化程度方面，低分化癌BRAF突变检出率达9.8%(13/132)，明显高于高/中分化癌；肿瘤最大径≥4 cm和有淋巴结转移的癌组织中BRAF突变检出率也明显较高；肿瘤pTNM分期方面，Ⅰ期癌组织中BRAF突变检出率仅为0.9%，Ⅱ期上升为2.3%，Ⅲ/Ⅳ期癌组织中检出率上升至4.7%，提示存在BRAF基因突变的结直肠癌进展较快，与临床所见一致。既往研究[15]也显示，BRAF基因突变的结直肠癌患者5 a生存率明显降低。

综上，本研究结果提示，KRAS基因突变与结直肠癌组织学类型和分化程度有一定相关性，而BRAF基因突变与结直肠癌诸多不良预后相关临床病理特征关系密切。对结直肠癌患者进行准确的基因分析有助于临床开展个体化的精准治疗，提升患者预后和生活质量。本研究整理了单中心1 205例结直肠癌根治标本的详细检测数据，提供了宝贵的循证医学数据，我们进一步将完善随访数据，进行更深入的探讨。