纳米四氧化三铁强化海藻酸钠包埋希瓦氏菌MR-1的甲基橙脱色性能

黄弘杨,黄津津,王国祥,吴向阳,沈 楠,孙 丽

(1.江苏大学环境与安全工程学院,江苏 镇江 212013;2.南京师范大学环境学院/江苏省水土环境生态修复工程实验室,江苏 南京 210023;3.无锡市滨湖区水利局,江苏 无锡 214071)

希瓦氏菌MR-1的胞外电子转移是偶氮染料降解的限速步骤[12]。通过添加导电材料可以提高电子转移效率,是强化希瓦氏菌MR-1脱色效率的有效途径之一[13]。据报道,导电材料如碳纳米管[13]、石墨烯[14]、纳米磁铁矿[15]等常被用来加速电子转移效率。例如,添加5 g·L-1的碳纳米管希瓦氏菌MR-1还原硝基苯的效率提高了74%[16]。因此,加入不同的导电材料可以加速希瓦氏菌MR-1向偶氮染料的电子转移效率,提高脱色效率。碳纳米管的加入虽然提高了脱色效率,但具有微生物密度低、不宜进行分离、使用周期短等缺点,仍然限制了其在工业上的应用。

固定化微生物技术可以把筛选出来的能降解特定物质的优势菌属固定在载体上,有效提高微生物密度,缩短反应时间,有利于提高污染物的去除率。隔离菌体与污染环境可缓解环境变化对水处理效果的影响,增大污水处理系统的稳定性和耐受性。固定化微生物技术根据微生物与载体之间的关系和相互作用分为5大类:包埋法、吸附法、交联法、共价结合法和复合固定化法。其中包埋法是最常用的方法。该技术使微生物截留在不溶于水的凝胶聚合物孔隙所构成的网络空间中,这种网络结构使微生物细胞在载体内部可以扩散但不能外泄,而且能让外部小分子底物渗入和内部微生物代谢产物排泄出去。包埋法的主要优点是技术操作简单、对微生物活性影响较小、固定化颗粒强度高、可控制被固定微生物的种类和数量、固定化颗粒易于长期贮藏,因而成为水污染控制领域的研究热点[17]。相对于碳纳米管而言,纳米Fe3O4具有较好的可回收性,是一种环境友好的导电材料,而海藻酸钠(sodium alginate,SA)是常用的微生物包埋材料,将SA、纳米Fe3O4和希瓦氏 MR-1有机结合形成导电微球是一种理想的工业废水高效脱色体系。并且这种结合方式可以避免纳米磁铁矿泄漏到环境中,提高导电材料的利用效率。但海藻酸钠包埋希瓦氏菌MR-1和纳米Fe3O4制备微球对甲基橙(MO)的脱色效率如何,以及微球的重复利用性如何,目前尚无明确报道[17]。

综上所述,该研究的主要目的是:(1)考察复合微球的抗形变性、机械强度等,以期评价复合微球的重复利用性能,以及纳米Fe3O4的添加对复合微球的重复利用性能的影响；(2)研究包含纳米Fe3O4及不包含纳米Fe3O4的复合微球对MO的脱色性能,比较分析纳米Fe3O4是否能够提高希瓦氏菌MR-1向MO的电子转移效率,进而提高复合微球的脱色性能。

1 研究材料与方法

1.1 培养基的配制

肉汤培养基(LB培养基)包括:5 g·L-1酵母提取物,10 g·L-1胰蛋白胨,10 g·L-1氯化钠。基本培养基(MM)包括:2.24 g·L-1C3H5O3Na,5.85 g·L-1NaCl,0.3 g·L-1NaOH,0.097 g·L-1KCl, 11.91 g·L-14-羟乙基哌嗪乙磺酸,1.498 g·L-1NH4Cl,0.67 g·L-1NaH2PO4·2H2O,1 mL微量元素溶液,微量元素溶液包括:1.5 g·L-1N(CH2COOH)3,30 g·L-1MgSO4·7H2O,5 g·L-1MnSO4·H2O,10 g·L-1NaCl,1 g·L-1FeSO4·7H2O,1 g·L-1CaCl2·2H2O,1 g·L-1CoCl·6H2O,1.3 g·L-1ZnCl2,0.1 g·L-1CuSO4·5H2O,0.1 g·L-1AlK(SO4)2·12H2O,0.1 g·L-1H3BO3,0.25 g·L-1Na2MoO4·2H2O,0.25 g·L-1NiCl2·6H2O,0.25 g·L-1Na2WO4·2H2O。

1.2 实验方法

1.2.1希瓦氏菌MR-1(ATCC 700550)的培养

将菌种接种到LB培养基中,置于30 ℃摇床中培养12 h,然后在高速离心机中以8 000 r·min-1离心8 min(离心半径16 cm),倒出上清液,菌体沉淀用60 mL的MM培养基重新悬浮并混匀,待用。

1.2.2纳米Fe3O4的制备

100 mL高纯水在N2下氛围下加热到80 ℃,添加0.99 g FeCl2·4H2O和2.7 g FeCl3·6H2O到水中,待其完全溶解后加入10 mL NH4OH (w为25%),保持温度为80 ℃,在N2氛围下快速搅拌30 min。形成的Fe3O4纳米颗粒用磁铁收集,并用高纯水清洗4次,最后沉在高纯水中待用。

1.2.3海藻酸钠微球的制备

共制备了4组不同的微球,分别为SA微球(ck1)、SA/Fe3O4微球(ck2)、SA/希瓦氏菌MR-1微球(exp1)、SA/希瓦氏菌MR-1/Fe3O4微球(exp2)。制备步骤如下:(1)用50 mL溶液和1 g SA制备ck1;(2)以含1 g SA和30 mg 纳米Fe3O4的50 mL溶液制备ck2;(3)以含1 g SA的40 mL溶液与10 mL的希瓦氏菌MR-1悬浮液混合,制备exp1;(4)用含1 g SA和30 mg 纳米Fe3O4的40 mL溶液与10 mL的希瓦氏菌MR-1悬浮液混合,制备exp2。将4种混合物逐滴滴加到盛有w为3% CaCl2溶液的烧杯中,制备出复合包埋微球。制备好的微球用高纯水洗3次后加入高纯水在烧杯中保存备用。所有种类的微球同时制备3份进行实验。

1.2.4MO的脱色实验

在160 mL的血清瓶中添加60 mL的MM培养基,将制备得到的包埋微球转移到血清瓶中。加入MO溶液,使瓶中的MO浓度为50 mg·L-1。氮气吹扫5 min使其保持厌氧状态,之后加橡皮塞和铝帽,放入30 ℃摇床中,保持转速为90 r·min-1。

第1次取样在实验开始0.25 h时,此后每30 min取样1次,每次取样均为2 mL。所有样品在464 nm下进行紫外-可见分光光度测试。脱色实验循环进行4次,每次间隔约18 h,以每次的实验数据为1个周期进行分析;每次实验结束后血清瓶仍放入30 ℃摇床中,保持转速为90 r·min-1,下一次实验前取出更换新的MO模拟废水。4次脱色实验均使用同一批制备出的微球。

1.2.5指标测定

(1)水凝胶流变性

采用TA-AR2000平行板(CP 25-2)流变仪,两平板间距固定为1 mm,测试温度30 ℃。水凝胶稳态流动行为在剪切速率为0.01～50 s-1范围内测量。动态流变行为测量之前,首先在固定震动频率为1 Hz的条件下在0.01～10的应变范围内进行应力扫描以确定其限性粘弹区,然后固定应变为0.1进行动态流变实验。

(2)扫描电镜SEM测试

取表面和内部各一小块经预处理和冷冻干燥后的海藻酸钠微球置于导电胶上,测试之前采用气相沉积的方法在样品表面喷金,使样品导电。使用JSM6700F扫描电镜(操作电压5.0 kV)进行观测。

(3)机械强度测试

分别取4种海藻酸钠微球ck1、ck2、exp1、exp2放置于相同浓度的溶液中,在室温下以200 r·min-1的速率在磁力搅拌器上平稳持续搅拌,转子规格10 mm×30 mm,每隔1 h捞取微球观测破损率,记录4种海藻酸钠微球完整存在的时间。

(4)傅里叶转换红外光谱测试

将冷冻干燥的海藻酸钠微球进行红外光谱测定,扫描范围400～4 000 cm-1。

(5)XRD测试

对制备好的Fe3O4粉末用X射线衍射仪进行测试,观察衍射峰出现的位置。测试条件:2θ范围为10°～80°。

(6)数据分析方法

数据采用Excel 2016软件进行整理,所有图形采用Origin Pro 8.0软件绘制。

2 结果与讨论

2.1 微球的表征结果

2.1.1Fe3O4的XRD分析

Fe3O4特征峰的2θ值为30.201°、35.487°、43.077°、57.123°、62.674°(图1)[17],通过水热法制备Fe3O4较为成功。

2.1.2微球的形态

包埋微球平均粒径约2.0～2.5 mm,包埋颗粒可为微生物提供大量的有效接触和附着的比表面积,且颗粒结构能够保护微生物免受水力的扰动和冲刷的影响。ck1组中微球是SA微球,无色透明(图2);exp1组中微球是SA中掺杂希瓦氏菌MR-1,颜色为乳白色;ck2和exp2组中微球因为添加了导电材料Fe3O4均呈黑色。4组微球的形态相同,都是均匀球状颗粒,表明制备的包埋微球较为成功。

在MO脱色实验后观察可见,ck1组中微球的颜色变为橙色,应该是由吸附甲基橙引起的;而exp1组中微球的粉红色是由N,N-二乙基对苯二胺(DPD)氧化引起的,因为甲基橙可被希瓦氏菌MR-1降解为对氨基苯磺酸(4-ABA)和DPD[4],而DPD在暴露在空气中时可被氧化成粉红色[18](图3)。ck2和exp2组中微球的颜色变化不明显,主要是因为添加的Fe3O4在微球中显黑色,覆盖了其他的颜色。

2.1.3扫描电子显微镜(SEM)观测

对4组包埋微球的表面进行SEM观测,结果如图4所示。可以看到ck1和ck2组包埋微球样品的表面较为光滑,只有少量褶皱。添加了希瓦氏菌MR-1后,exp1和exp2组包埋微球微观形貌要更饱满一些,褶皱较多,且有一些较为明显的凸起,应该是希瓦氏菌MR-1包裹在微球表面造成的。

2.1.4傅里叶红外光谱(FTIR)分析

如图5所示,4组样品的FTIR谱图没有明显的区别。

在3 340 cm-1处存在1个较强的吸收峰,该峰为羟基的伸缩振动峰,说明样品中含有大量的羟基。1 603 cm-1和1 402 cm-1处出现的2个特征峰分别为—COO—的反对称和对称伸缩振动峰,1 210 cm-1处出现的特征峰为C—O或C—H的伸缩振动峰,在1 000 cm-1左右出现的尖锐特征峰为C—C或C—O—C的伸缩振动峰[19]。从FTIR谱图可以看到ck1、ck2、exp1和exp2这4组样品的出峰位置基本一致,且峰型大致相同;对比SA的特征峰数值,4个样品的红外特峰完全符合,均为SA的特征峰。结果表明SA、Fe3O4以及希瓦氏菌MR-1只是简单的物理结合,并没有化学反应的发生,所以没有官能团的变化且没有产生新的官能团。

2.1.5流变性测试

复数模量G*指材料发生形变时抵抗形变的能量大小[20],可以用来表明抗形变性[21]。如图6所示,在较低的应变条件下(<0.01%),ck1和ck2组微球的复数模量要大于exp1和exp2组微球,希瓦氏菌MR-1的添加可能降低了微球的抗形变性。在较高应变条件下(>0.01%),ck2和exp1组微球的复数模量下降很快,降低到了低于exp2组微球的程度。

而exp2组微球的变化不大,仍保持一个相对较高的数值,可能因为纳米Fe3O4和微生物的共同作用维持了微球的抗形变性,ck2组和exp1均没有这种效果。exp2微球在较低的应力扫描期间(<0.01%)显示出最低的损耗系数和更好的固体性质。因此,根据流变性推测可知,该研究中制备的exp2组微球在较高应变条件下(>0.01%)能维持自身性状,抵抗外界压力产生的形变,有利于重复使用。

2.1.6机械强度测试

在机械搅拌条件下4组包埋微球的完整存在时间有较大差距。ck1组包埋微球在连续搅拌15 h后开始破碎,搅拌18 h后微球基本完全破碎;而添加了Fe3O4的ck2组和exp2组的包埋微球完整存在时间均超过7 d;仅添加了希瓦氏菌的exp1组包埋微球完整存在时间为3 d,不如ck2和exp2组的完整存在时间长,说明Fe3O4的加入极大增强了微球的机械强度,有利于包埋微球的重复利用。添加Fe3O4的ck2组和exp2组的包埋微球机械强度的增加,可能是由于Fe3O4颗粒之间的磁性,使合成包埋微球的物质之间的结合更为牢固。

2.2 MO脱色实验

如图7所示,ck1和ck2组的包埋微球对MO的脱色率极低,2种包埋微球对MO的脱色效率没有明显差距,且均为吸附产生的效果,表明纳米Fe3O4基本不吸附MO。添加希瓦氏菌MR-1的exp1和exp2组包埋微球对MO的脱色效果较好,表明希瓦氏菌MR-1具有较好的MO降解性能。在包埋微球重复利用过程中,exp1组微球对MO的脱色率从第1循环的100%降低到第4循环的53.19%左右,而exp2组的脱色率虽亦有所下降,但在第4循环依然维持在77.83%,体现出添加纳米Fe3O4对MO脱色效率有明显提升作用。针对重复利用微球对MO进行脱色的过程中出现的脱色效率有所下降的现象,之前的研究也出现了在重复利用微生物包埋微球的实验中希瓦氏MR-1对Cr6+的生物还原能力降低的结果[22]。原因可归结为以下3种情况:(1)循环之间的间歇性饥饿可能会抑制希瓦氏菌MR-1的生物活性,从而导致希瓦氏菌MR-1的MO脱色能力降低;(2)此外,MO及其代谢产物的毒性可能是另一个原因;(3)添加了纳米Fe3O4的exp2组中的包埋微球完整存在时间大于7 d,增强微球机械强度的同时也有利于减少希瓦式菌MR-1从微球中流逝,较高的希瓦氏菌数量也是该组脱色效率较高的原因之一。2组微球在第1循环中的差距不大,可能是此时希瓦氏菌的活性处于实验中的最高点,随着实验的进行希瓦氏菌活性逐渐降低,添加纳米Fe3O4加速电子转移,提高了微球对MO的脱色性能。希瓦氏菌 MR-1还原Cr6+和MO主要通过CymA和Mtr呼吸途径[15],碳纳米管的加入可以提高该途径的电子传递效率[18]。其次,纳米Fe3O4可能作为细胞外电子转移的桥梁,通过另一种未知的呼吸途径对MO进行脱色[22]。因此,exp2组的希瓦氏菌MR-1或可通过上述2种途径对MO进行脱色强化,而exp1组的希瓦氏菌MR-1只有1种脱色途径,因此exp2组的希瓦氏菌MR-1的脱色能力明显强于exp1组。

在包埋微球重复利用过程中对exp1和exp2组中MO的脱色效率进行比较,得到4个循环过程中经过相同反应时间的MO脱色效率(表2)。在第1循环(0～1.25 h)过程中,经过0.75 h的反应时间,exp1组和exp2 组中50 mg·L-1的MO的脱色率分别是89.06%和85.54%,2组的脱色效率相近。与悬浮状态的希瓦氏菌MR-1对MO的脱色效率相比,在悬浮希瓦氏菌MR-1体系中40 mg·L-1的MO进行脱色需要至少6 h[3]。由此可知,该研究中研制的包埋微球对MO进行脱色的效率明显较高。在第2循环(24.25～25.50 h)过程中,经过0.75 h的反应时间(即25 h)exp2组中MO的脱色率为90.71%,而exp1中MO的脱色率仅有70.86%;经过1.75 h的反应时间(即26 h),2组中MO基本完全脱色。第3循环(48.50～50.25 h)过程中,经过0.75 h的反应时间(即48.5 h),exp1和exp2中MO的脱色率是38.75%和52.31%,差值为13.56%;经过1.75 h的反应时间(即50.25 h),exp1和exp2组中MO脱色率为88.03%和99.41%,差值为11.38%;在第4循环(72.25～74.50 h)过程中,经过0.75 h的反应时间(即73 h),exp1和exp2组中MO脱色率为30.96%和37.19%,差值6.23%;经过1.75 h的反应时间(即73.50 h),exp1和exp2组中MO脱色率为53.19%和77.83%,差值24.64%。以上结果均可以显示出添加Fe3O4对MO脱色效率的提升作用。

表1 exp1和exp2组包埋微球对MO的脱色效率

3 结论

针对希瓦氏菌对偶氮染料进行脱色过程中脱色效率较低的关键问题,提出利用海藻酸钠包埋希瓦氏菌MR-1和纳米Fe3O4对MO进行脱色处理,以提高其细胞密度和电子传递效率,进而提高对MO的脱色效率。通过比较4种包埋微球的形态学、流变性、机械强度以及脱色效率,得到以下结论:

(1)Fe3O4的加入提高了微球的机械强度,有利于微球的重复利用,且对微球的形貌基本不产生影响,并且不会发生化学反应,不产生新的物质。

(2)Fe3O4的加入加速了希瓦氏菌MR-1向MO转移电子的效率,从而提高了包埋微球对MO的脱色效率。

(3)循环利用后续过程中出现的脱色效率下降问题有待进一步的探索,以提高微生物包埋微球的重复利用效率。

海藻酸钠包埋微球可以防止纳米材料泄漏到自然环境中,是纳米材料应用于废水处理的理想途径。并且添加纳米导电材料可以改善细胞向污染物的电子转移效率,进而提高污染物处理效率。但是在实际的连续应用过程中,需要进一步提高海藻酸钠包埋微球的性能。