QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性产品中9种β-受体激动剂残留

肖 勇，万伟杰，邬 磊，王冬根，周瑶敏，徐 俊

(江西省农业科学院 农产品质量安全与标准研究所/农业农村部 畜禽产品质量安全风险评估实验室(南昌)/江西省农产品质量安全重点实验室，江西 南昌 330200)

β-受体激动剂，俗称瘦肉精，是具有苯乙醇胺结构的肾上腺素类的合成药物[1]。在临床医学上，将其作为平喘性药物，用于治疗支气管哮喘的相关疾病[2]。以前，β-受体激动剂在畜牧生产中被广泛用作生长促进剂，因为它可以提高生猪的瘦肉率，减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本[3]。但研究发现[4-5]，β-受体激动剂化学性质和结构稳定，在动物组织中很难被分解，可通过食物链逐渐在人体内积累，若消费者长期食用这类食品，将可能会引起慢性或急性中毒，以及心血管和神经系统的病变，甚至可能诱发恶性肿瘤，因此中国和欧盟等许多国家均严厉禁止该类药物用于畜禽生产。其实早在2002 年，我国就将β-受体激动剂列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》[6]。近几年风险评估调查结果发现，在利益的驱使下，违法使用β-受体激动剂的现象依然严峻，尤其是盐酸克伦特罗的违禁使用[7]。

目前，β-受体激动剂类药物残留的检测方法主要有液相色谱法[8-9]、气相色谱-串联质谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11-12]等。液相色谱法仅靠保留时间定性，针对复杂样品的抗干扰能力差、灵敏度等均不能满足当前残留检测的要求；气质联用法的前处理步骤需衍生，操作繁琐、耗时较长；而液相色谱-串联质谱法灵敏度高、特异性强，并且可同时检测多种目标化合物，因此是现阶段最主要的检测技术手段。在前处理方面，常见的净化方法分为2种：一种是固相萃取法，另一种是QuEChERS法。在固相萃取的方法中，文献报道较多的是用PCX柱[13]、HLB柱[14]和混合型MCX柱[15]对样品进行净化，现行主流适用于动物源性β-受体激动剂检测的3种国标方法[16-18]、净化方式采用的也是固相萃取。固相萃取方法虽然净化效果好，但前处理过程繁琐、耗时长、效率低，不适宜用于大批量样品的检测。自2003年QuEChERS净化方法[19]首次发布以来，很多报道聚焦在农产品中农药残留样品处理方面，而对兽药残留检测方面报道则相对较少。

本文参照《动物源性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所自建方法)[20]，利用QuEChERS净化方式，联合超高效液相色谱-串联质谱建立了同时分析牛肉中9种β-受体激动剂的测定方法，优化了流动相、提取溶剂、定溶液和稀释倍数等关键环节，所建立的方法简便、快速、灵敏、实用，为动物源性食品中β-受体激动剂的监测提供了又一个快速、有效的方法，有利于提升对β-受体激动剂的监控水平，适用于在检测机构实验室开展大批量样品检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 6460-1295超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)，945605涡旋混合器(美国TALBOYS公司)，LXJ-IIB高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，YP5102电子天平(上海光正)，S210 pH计(梅特勒-托利多仪器公司)，THZ-92B回旋式振荡仪(上海博迅)，Milli-Q超纯水仪(默克公司)，SHZ-B恒温水浴锅(常州金坛友联)，N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司)。

试剂：特布他林标准品、沙丁胺醇标准品、莱克多巴胺标准品、克伦特罗标准品、沙丁胺醇-D标准品、克伦特罗-D9标准品(均为德国Dr.Ehrenstorfer公司提供)；西马特罗标准品、非诺特罗标准品、氯丙那林标准品、妥布特罗标准品、喷布特罗标准品(均为德国WITEGA公司提供)；P-QuEChERS-AOAC 1202提取盐包：内含6 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠(阿尔塔科技有限公司)；F-QuEChERS-AOAC 3202多功能针式过滤器：内含150 mg无水硫酸镁和50 mg PSA(阿尔塔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准储备液的配制：分别取上述9种β-受体激动剂和2种同位素内标对照品适量,精密称取,用甲醇溶解,制得100 μg/mL β-受体激动剂的储备液，于-20 ℃下避光储存。

标准中间液的配制：分别移取适量9种β-受体激动剂标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成10.0 μg/mL的混合标准溶液；移取适量2种同位素内标储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成10.0 μg/mL的混合内标溶液，均在-20 ℃下避光储存。

标准工作液：取上述混合标准中间液0.20 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成0.20 μg/mL的标准工作液；移取0.50 mL的2种同位素内标储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成0.50 μg/mL的混合内标溶液，均在-20 ℃下避光储存。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱温40 ℃；流动相：A相0.1%甲酸水溶液，B相甲醇溶液；流速0.4 mL/min；进样量10.00 μL；梯度洗脱步骤：0～0.50 min，维持2% B；0.50～4.00 min，2% B～35% B；4～5 min，35% B～80% B；5.00～5.50 min，80% B～90% B；5.5～5.7 min，90% B～2% B；5.7～9.0 min维持2% B。

1.2.3 质谱参数 离子源：电喷雾；扫描方式：正离子；电离电压：4.0 kV；检测方式：多反应监测；源温：325 ℃；干燥气流速：5 L/min；雾化气压力：50 psi；鞘流气温度：350 ℃；鞘流气流速：12 L/min。优化后的多反应监测试验条件见表1。

表1 9种β-受体激动剂和2种内标物质多反应监测参数

1.3 样品的处理

称取5 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中，准确加入0.02 mL 0.50 μg/mL的混合内标溶液、10 mL 0.2 mol/L乙酸铵缓冲液(pH=5.2)、0.04 mL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，振荡10 min，于37 ℃下避光水浴酶解16 h，酶解后放置至室温，加入10 mL 2%甲酸-乙腈溶液，再加入P-QuEChERS-AOAC提取盐包，涡旋振荡1 min，4500 r/min离心5 min，将离心后的上清液转移至15 mL离心管中，在离心管中加入5 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋混合30 s，4500 r/min离心1 min。吸取下清液以逐滴流出的速度匀速通过多功能针式过滤器至15 mL离心管中，准确吸取5 mL滤液，于50 ℃氮吹至近干，先加0.25 mL乙腈复溶，涡旋30 s，再加入0.75 mL 0.1%甲酸水溶液，混匀，过0.22 μm的滤膜，上机待测。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的优化 β-受体激动剂是在苯乙醇胺结构母核的基础上进行官能团修饰和改造后形成的一大类化合物，属于水溶性强和极性多样的化合物群。通过查阅文献[21-22]，多种兽药残留分析中一般采用乙腈、甲醇等有机溶剂作为提取试剂，甲醇、乙腈都可以降低高脂肪、高蛋白的基质干扰，但与甲醇相比，乙腈提取时带入的极性干扰物更少，有利于后续净化。本研究采用空白加标(2.0 μg/kg)的方式比较了1%甲酸-乙腈[23]、2%甲酸-乙腈[24]、5%甲酸-乙腈[25]、0.1%乙酸乙腈[20]、2%乙酸乙腈、5%氨水乙腈[26]、80%乙腈-水[27]、纯乙腈等8种溶剂提取，定溶液选择0.1%甲酸水∶甲醇=9∶1。结果表明：在提取溶剂乙腈中加入适当的酸后，9种化合物的回收率普遍较高，其可能原因是β-受体激动剂一般是弱碱性化合物[24]，在酸性溶液中呈现离子状态有利于提取；在酸性条件下，西马特罗、沙丁胺醇、氯丙那林和克伦特罗均有较理想的回收率(>80%)，但莱克多巴胺只有在2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈的提取条件下能实现优于其他提取剂的回收，另外特布他林在5%甲酸-乙腈的提取条件下的回收率明显低于2%甲酸-乙腈，故试验选择2%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂(图1)。

图1 不同提取溶剂的回收率比较

2.1.2 定溶液的选择 样品上机前复溶液的确定直接影响方法的灵敏度，本文比较了定溶液中不同有机相比例后发现，在定溶液中加入一定比例的有机相可明显提高对喷布特罗的响应[28]，可有效地提高其回收率。但使用有机相比例过大时，如在使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1[19]时发现，西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗和特布他林的出峰均出现分叉的情况，峰型较差，结果如图2所示。

图2 使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1作为定溶液峰型分叉效果图

最后，本试验比较了文献报道中常见的5种定溶液组合的回收率，定溶液分别为v0.1%甲酸水∶v甲醇=9∶1[29]、0.1%甲酸水[14,24,30]、350 μL甲醇+650 μL 0.1%甲酸水[23]、250 μL乙腈+750 μL 0.1%甲酸水、v0.1%甲酸水∶v乙腈=9∶1[24]，结果如图3所示。定溶液中水相与有机的比例对极性敏感物质有一定的影响，本试验先用250 μL乙腈对氮吹干后的物质进行涡旋复溶，然后再加750 μL 0.1%甲酸水混匀，如此操作下各种化合物的峰型和回收率均达到满意的效果。

图3 5种定溶液试验所得各种化合物的回收率

2.1.3 流动相选择 基于β-受体激动剂类药物均具有较强的水溶性，而且本研究中的9种化合物既有极性(如沙丁胺醇)，也有弱极性(如克伦特罗、妥布特罗)，还有非极性(如喷布特罗)等，所以需要选择合适的流动相才能将各种物质在不同的时间被洗脱下来，从而达到有效分离的目的。有文献表明，在正离子扫描的模式下，流动相加入一定量的甲酸可以提高离子化效率和分离度[31-32]，故本文比较了甲醇、乙腈作为有机相分别与0.1%甲酸溶液组成流动相的效果。结果表明：将甲醇作为有机相时，各种化合物响应值较高；而当甲醇中加入0.1%甲酸后，对待测物响应强度的影响不大，因此本研究选择0.1%甲酸水-甲醇溶液作为流动相。在该流动相体系下，所有化合物的峰型尖锐，相互无干扰，并且可以在7 min内完成目标物的分离和色谱柱的分离。各种目标化合物的选择离子流色谱图见图4。

图4 各种目标化合物的选择离子流色谱图

2.2 标准曲线、线性范围及定量限

本方法通过使用基质标准曲线对9种β-受体激动剂进行分析，以基质标准工作液的浓度作为横坐标，各种药物定量离子对峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。β-受体激动剂在0.25～10.00 ng/mL范围内线性关系良好，各种药物的回归方程及相关系数见表2。试验采用在空白牛肉中添加目标组分的方法，依据定性或定量离子对色谱峰的信噪比大于10为定量限，得出各种药物的定量限为0.25 μg/kg。

表2 牛肉中9种β-受体激动剂的标准曲线

2.3 精密度与回收率试验

取0.25、0.50、2.50 μg/kg共3个梯度水平的阳性添加试样，按照“1.3样品的处理”的步骤操作，每个浓度进行5个平行试验，以相对标准偏差(RSD，%)计算精密度，以实测浓度与理论添加浓度之比，计算各个被测物质的方法回收率，结果在低(0.25 μg/kg)、中(0.50 μg/kg)、高(2.50 μg/kg)浓度下，β-受体激动剂的精密度小于10%，回收率在67.73%～114.13%之间，具体结果见表3。

表3 β-受体激动剂的精密度和回收率(n=5)

2.4 实际样品的分析

对日常检测任务中收集的4份阳性牛肉样品(T1、T2、T3、T4)，分别选用本方法、国标GB/T 21313—2007和农业农村部1025号公告-18—2008中的方法进行了测试，样品中均检出有克伦特罗，结果见表4。说明该方法能够实现对牛肉中β-受体激动剂的残留检测。

表4 实际样品分析结果 μg/kg

3 结论

本研究以2%甲酸-乙腈溶液作为提取剂，采用QuEChERS前处理技术，结合高效液相色谱-串联质谱技术，通过优化前处理条件和质谱参数，建立了快速测定牛肉中9种常见β-受体激动剂残留的方法，大大简化了前处理过程；结合新型净化方法，降低了基质对分析物的干扰，提高了样品的检测效率，使得检测更加准确、可靠，为今后畜产品中受体激动剂的残留检测提供了一种新的方法。