LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭

邓俊亮 华美香 陈键腾

(南方医科大学附属新会医院呼吸内科，江门 529100)

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球范围内与癌症相关死亡的主要原因。根据肺癌的分化程度和形态特征，其可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，在所有肺癌患者中，有85%是非小细胞肺癌[1]。大多数非小细胞肺癌患者表现为局部晚期或转移性疾病，可选择的治疗方式有限，导致患者的5年总生存率较低[2]。因此，了解非小细胞肺癌的发病机制，寻找新的治疗对提高患者生存率具有重要意义。越来越多的证据表明，非小细胞肺癌的发生和发展涉及许多分子变化，例如由表观遗传调控诱导的基因表达的改变[3-4]。近年来，已有研究证明长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)直接参与肿瘤的发展和转移过程[5]。胸腺生成素反义转录本1(thymopoietin antisense transcript 1，TMPO-AS1)是一种与DNA复制和细胞周期进程密切相关的lncRNA[6]。ZHENG等[7]分析了来自癌基因组图谱的肺腺癌患者的lncRNA表达谱和临床数据显示，TMPO-AS1在肺腺癌患者中呈高表达，且与患者预后密切相关。PENG等[8]的研究同样显示，TMPO-AS1可能是肺腺癌预后的标志分子。然而，目前未见TMPO-AS1在肺癌中的作用及可能机制的研究。生物信息学预测发现，TMPO-AS1和miR-204-3p间存在靶向结合位点，但TMPO-AS1和miR-204-3p是否存在靶向关系调控肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭鲜有报道。因此，本实验探究TMPO-AS1对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及对miR-204-3p的靶向关系。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支气管上皮细胞系HBE(美国ATCC)；DMEM培养基、MTT试剂(美国Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素混合液(美国Abcam公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Intvitrogen公司)；TMPO-AS1 siRNA及阴性对照siRNA control(上海吉凯制药技术有限公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)；miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut荧光素酶重组载体质粒(上海生工生物工程有限公司)；荧光素酶报告检测试剂盒(美国Promega公司)；TMPO-AS1过表达重组载体质粒及空载质粒(北京赛百盛基因技术有限公司)；PCNA、Ki-67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2和MMP-9单抗及HRP标记的二抗(英国Abcam公司)；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(美国Coring公司)；细胞裂解液、BCA试剂盒、超敏ECL发光试剂(碧云天生物技术研究所)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液培养A549、H1975、H1299、H1650和HBE细胞，放置在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中常规培养。每2 d换液，待细胞生长汇合率至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取指数增殖期的细胞用于实验研究。

1.2.2细胞转染 生长状态良好的肺癌A549细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞汇合度达50%时，使用LipofectamineTM2000转染试剂将TMPO-AS1 siRNA或阴性对照siRNA control转染至A549细胞，具体步骤参照转染试剂说明书。将转染TMPO-AS1 siRNA的A549细胞命名为si-TMPO-AS1组，转染siRNA control的A549细胞命名为si-NC组，转染空脂质体的A549细胞命名为Control组，三组A549细胞转染48 h行qPCR检测。

1.2.3qPCR检测 收集对数生长期的A549、H1975、H1299、H1650和HBE细胞以及转染48 h三组A549细胞，使用Trizol试剂分别抽提总RNA，纯化RNA，并使用分光光度计检测RNA样品的纯度和丰度。使用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒行qPCR检测，反应体系为：cDNA 2 μl、2×SYBR Green Mix 10 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、ddH2O 6 μl。反应程序为：95℃ 5 min；随后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 10 s循环40次。以GADPH为内参检测细胞中TMPO-AS1的表达水平，以U6为内参检测细胞中miR-204-3p的表达水平。所用引物序列：TMPO-AS1正向引物：5′-TCAAACCCGTATTACCGATCCA-3′，反向引物：5′-ACCCTACATCCAAGGTCTCCT-3′；GADPH正向引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，反向引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；miR-204-3p正向引物：5′-CGCTCGAGCCTTCTTCCTTGCCTCTCA-3′；反向引物5′-CAGCGGCCGCGTAAAATTTGACATGGAC-3′。U6正向引物：5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′；反向引物：5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。反应结束后分别获得目的基因和内参基因的Ct值，采用相对定量2-ΔΔCt法进行分析。实验独立重复3次。

1.2.4荧光素酶报告实验 在线生物信息学软件LncBase Experimental v.2预测TMPO-AS1在miR-204-3p上的结合位点。依据预测结果扩增miR-204-3p上含有及突变的TMPO-AS1结合位点的片段，并插入到荧光素酶报告载体上(分别为miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut荧光素酶重组载体质粒)，该部分由上海生工生物工程有限公司完成。用miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut分别与TMPO-AS1过表达重组载体质粒或空载质粒共同转染A549细胞，继续培养48 h，根据荧光素酶报告检测试剂盒分别测定荧光素酶活性，计算各组细胞中相对荧光素酶活性，实验独立重复3次。

1.2.5MTT检测 对数期的A549细胞接种到96孔板中，待细胞汇合率至50%时按照1.2.2进行转染，Control组、si-NC组和si-TMPO-AS1组A549细胞转染48 h时，向每孔细胞加入20 μl MTT溶液，随后放置在37℃培养箱常规培养4 h，取出细胞培养板，吸取细胞上清液，再加入150 μl二甲基亚砜，充分混匀后放置到振荡仪上反应10 min，使用酶标仪测定各孔吸光度值(A值)，分别计算三组A549细胞活性，细胞活性(%)=实验组A值/对照组A值×100%。实验独立重复3次。

1.2.6流式细胞术检测 A549细胞按照1.2.2转染48 h后，分别收集三组细胞约1×105个，向细胞中加入Binding Buffer缓冲液500 μl重悬细胞，制成单细胞悬液，将500 μl细胞悬液加入流式管中，再分别向流式管中加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液，混匀后于室温下避光反应15 min，在1 h内使用流式细胞仪检测，分析三组A549细胞凋亡率，实验独立重复3次。

1.2.7Transwell侵袭实验 转染后三组A549细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，用不含血清的培养液重悬细胞，饥饿处理24 h，将细胞浓度调整为2×105个/ml，取200 μl细胞悬液接种到Matrigel胶预先包被的Transwell小室的上室，在小室下层添加500 μl含10%血清的培养液，放置在37℃常规培养箱继续孵育48 h。取出小室，用湿润的棉签擦去上层未穿过基底膜的细胞，用多聚甲醛固，结晶紫染色，显微镜下观察并计数，实验重复3次，统计三组A549细胞穿膜细胞数目。

1.2.8Western blot检测 使用细胞裂解液分别提取转染48 h三组A549细胞总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白样品进行浓度测定并调平。配制10%的SDS-PAGE凝胶，取等量蛋白上样，电泳分离蛋白后转印到PVDF膜上。实验5%脱脂奶粉室温封阻2 h，洗膜并加入相应一抗，根据说明书将PCNA和Ki-67一抗1∶500稀释，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9一抗1∶600稀释，MMP-2和MMP-9一抗1∶800稀释，4℃过夜孵育。第2天洗膜后再加入1∶2 000稀释的二抗，室温孵育1.5 h，洗膜后滴加超敏ECL显色液，在暗室显影曝光，采集图像，使用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，实验重复3次。

2 结果

2.1TMPO-AS1在肺癌细胞系中的表达 qPCR结果显示，与人正常支气管上皮细胞系HBE比较，人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650中TMPO-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。在肺癌细胞系中A549细胞中TMPO-AS1的表达水平最高，因此后续实验选其为研究对象。

表1 TMPO-AS1在HBE细胞系和不同肺癌细胞系中的表达

2.2TMPO-AS1对miR-204-3p表达的影响 qPCR结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞TMPO-AS1的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-204-3p的表达水平明显升高(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组中TMPO-AS1和miR-204-3p的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 三组A549细胞中TMPO-AS1和miR-204-3p的表达比较

2.3TMPO-AS1靶向结合miR-204-3p 生物信息学预测显示，TMPO-AS1与miR-204-3p序列存在连续结合位点，说明TMPO-AS1和miR-204-3p可能存在靶向关系。荧光素酶报告实验结果显示，TMPO-AS1能够明显降低野生型miR-204-3p细胞的相对荧光素酶活性(P<0.05)，对突变型miR-204-3p细胞的相对荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。见图1。

图1 TMPO-AS1靶向miR-204-3p

2.4沉默TMPO-AS1对A549细胞增殖能力的影响 MTT实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞活性显著降低(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞中增殖相关蛋白PCNA和Ki-67的表达显著下调(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞中PCNA和Ki-67的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表3。

表3 三组A549细胞活性及PCNA和Ki-67的表达水平比较

图2 Western blot检测三组A549细胞中PCNA和Ki-67蛋白的表达

2.5沉默TMPO-AS1对A549细胞凋亡率的影响 流式细胞术实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达显著上调(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3和表4。

表4 三组A549细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达水平比较

图3 沉默TMPO-AS1对A549细胞凋亡的影响

2.6沉默TMPO-AS1对A549细胞侵袭能力的影响 Transwell实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞侵袭数目明显下降(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞侵袭数目差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞中侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达显著降低(P<0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4和表5所示。

表5 三组A549细胞穿膜数目及MMP-2和MMP-9的表达水平比较

图4 沉默TMPO-AS1对A549细胞侵袭能力的影响

3 讨论

非小细胞肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在男性中发病率更高，也是我国常见的恶性肿瘤[9]。近来，尽管在非小细胞肺癌的临床治疗方面已经取得了很大的进步，但是患者的总生存时间并没有显著改善，并且一个关键的问题是缺乏有价值的生物分子标志物[10]。因此，迫切需要了解非小细胞肺癌进展和转移的分子机制，以改善疾病发作时的诊断和有效治疗。lncRNA作为一种非蛋白质的转录本，通常被定义为长度超过200个核苷酸，最近引起了越来越多学者的关注。越来越多的证据表明，lncRNA可能在多种癌症的生物学过程中发挥关键作用，并作为包括预后生物标志物和潜在治疗靶标在内的许多临床应用的基础[11-12]。最近有报道显示，lncRNA的异常表达可能与表观遗传学改变有关，并参与了癌细胞的增殖和转移[13]。TMPO-AS1作为TMPO反义转录本1，广泛参与调控细胞的增殖过程。目前有证据表明，TMPO-AS1在人类恶性肿瘤的进展中发挥重要作用，且与患者预后不良密切相关。如TMPO-AS1在前列腺癌中过度表达，能够促进肿瘤的进展，且被认为是前列腺癌预后不良的标志物[14]。本实验通过qPCR检测发现，TMPO-AS1在人肺癌细胞系中的表达显著高于人正常支气管上皮细胞系，这提示TMPO-AS1可能在肺癌细胞中发挥致癌基因的作用。选取TMPO-AS1表达量最高的肺癌A549细胞为研究对象，通过转染TMPO-AS1 siRNA沉默其表达，结果发现，沉默TMPO-AS1后A549细胞增殖和侵袭能力显著降低，增殖相关蛋白PCNA和Ki-67的表达明显下调，凋亡率明显升高，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达明显上调，表明TMPO-AS1在肺癌中发挥促癌的作用。这与以往QIN等[15]关于TMPO-AS1通过调节其自然反义转录物TMPO促进非小细胞肺癌的进展的研究相符。

研究显示，微小RNA(microRNA，miRNA)可以调节各种生物学过程，并在癌症的发展和转移中发挥关键作用[16]。有趣的是，在包括癌症在内的许多疾病中都发现了miRNA和lncRNA之间的交叉调控。miRNA可以靶向lncRNA以降低lncRNA的稳定性，而lncRNA也可以充当竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)来拮抗miRNA或lncRNA[17]。已发现miR-204-3p在几种肿瘤中表达失调，例如胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌，参与调控肿瘤的发生和发展[18-20]。在透明细胞肾细胞癌中具有较高miR-204-3p表达的患者的总生存期则明显更高，ERβ通过改变ERβ/circATP2B1/miR-204-3p/FN1信号轴来促进透明细胞肾细胞癌细胞的侵袭[21]。一项研究显示，miR-204-3p在头颈部肿瘤中作为抑癌基因发挥作用，能够抑制头颈部肿瘤的转移[22]。研究显示，miR-204-3p在肺癌组织中呈低表达，与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移等密切相关[23-24]。本研究首先通过生物信息学预测发现TMPO-AS1和miR-204-3p存在相似结合位点，沉默TMPO-AS1后A549细胞中miR-204-3p的表达明显升高，通过荧光素酶报告实验验证了TMPO-AS1和miR-204-3p存在靶向调控关系。本研究结果显示沉默TMPO-AS1表达后可明显促进miR-204-3p的表达，沉默TMPO-AS1可抑制肺癌A549细胞的增殖和侵袭，并促进细胞凋亡，提示沉默TMPO-AS1表达可能靶向上调miR-204-3p的表达而抑制PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9表达及促进Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达从而抑制肺癌A549细胞的增殖和侵袭，并促进细胞凋亡。

综上，TMPO-AS1在肺癌细胞系中呈高表达，沉默TMPO-AS1可通过诱导miR-204-3p的表达抑制肺癌A549细胞增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。本实验为进一步了解非小细胞肺癌发病机制及探索潜在的治疗靶点提供一定的实验依据。