敲除ABRO1对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)LPS/TLR4通路活化的影响①

李东旭 张 文 葛志强 詹轶群 尹荣华 杨晓明

(天津大学化工学院制药工程系，天津 300072)

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，由脂质和多糖构成，是天然免疫反应中最有效的刺激因子之一[1]。Toll样受体4(TLR4)是一种与天然免疫反应密切相关的受体，广泛分布于免疫细胞的细胞膜表面。TLR4通过识别LPS活化NF-κB和MAPK信号通路等，诱导多种炎症相关基因的表达，进而介导免疫应答和抵抗病原体入侵[1-2]。此外，LPS诱导的TLR4信号通路的过度激活是多种炎症性疾病发生的主要原因，如败血症、内毒素导致的慢性肝病重症化等[3]。发现新的LPS/TLR4信号通路的调控因子及调控机制对相关疾病的治疗具有重要意义。

ABRO1(abraxas brother 1)，也被称为KIAA0157或FAM175B，与BRCC36、MERIT40和BRCC45共同组装形成BRISC复合体。BRISC复合体是一种特异性去除K63泛素化的去泛素化酶，其中ABRO1与BRCC3是最重要的两个亚基，BRCC3具有去泛素化功能，ABRO1具有酶活性的催化功能，共同调节BRISC的去泛素化酶活性[4]。ABRO1在各类细胞中均有表达，参与不同的生理过程，包括炎症反应、细胞分裂、DNA损伤反应等[5-6]。ABRO1敲除小鼠可以抵抗LPS诱导的败血症，其外周血单个核细胞中，IL-1β和IFN-β等细胞因子的mRNA水平明显降低，在小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中，敲除ABRO1和BRCC3并不影响LPS/TLR4信号通路活化，然而ABRO1和BRCC3缺失会阻断NLRP3炎症小体组装，进而抑制IL-1β和IL-18分泌[7-8]。综上所述，ABRO1在LPS/TLR4通路活化中的作用仍未确定。

本文主要探讨ABRO1在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)细胞中对LPS/TLR4信号通路的调节作用[8]。研究发现敲除ABRO1并不影响LPS/TLR4信号通路的活化，提示ABRO1对LPS/TLR4通路的调节可能具有细胞选择性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1小鼠 ABRO1敲除小鼠(C57BL/6)由本实验室建立并饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心。选取SPF级8周龄、体重20～22 g、雌雄ABRO1杂合小鼠进行交配，选择孕期为13.5 d的孕鼠分离MEF细胞。

1.1.2细胞和质粒 HEK-293T细胞购自ATCC，用含10%FBS的DMEM完全培养基培养；慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2和荧光素酶报告基因载体pCDH-NF-κB-Luciferase为实验室保存。

1.1.3主要试剂 DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS，Gibco公司)；LPS(Sigma公司)；Pierce ECL化学发光底物(美国Thermo scientific 公司)；ABRO1抗体为实验室定制(ABclonal公司)；ACTB抗体(ABclonal公司)；p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK和JNK抗体(CST公司)；IL-6流式微球阵列(CBA)试剂盒(BD公司)；双荧光素酶报告基因活性检测试剂盒、反转录试剂盒(Promega公司)；TRIzol(北京威格拉斯公司)；定量PCR试剂盒(Thermo 公司)；慢病毒包装试剂盒(System Biosciences公司)。

1.1.4主要仪器 细胞培养箱3111型(美国Thermo scientific 公司)；NanoDrop 2000超微量分管光度计(美国Thermo scientific 公司)；流式细胞仪LSRFortessa型(BD公司)；PCR仪(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；显微镜成像(奥林巴斯)；荧光检测仪(Promega公司)等。

1.2方法

1.2.1MEF的分离培养 将怀孕13.5 d的ABRO1杂合小鼠放到鼠笼里，脱颈椎法处死小鼠，将小鼠浸泡在酒精中3～4 min，然后将已处死的孕鼠拿到超净台上的盘子中，用剪刀和镊子取出胚胎，将胚胎放到PBS中，去除头、四肢和内脏，转移至新的培养皿中，用手术刀细细切碎，37℃胰酶消化30 min，每隔5 min轻轻吹打使之消化充分，然后加入含10%FBS的DMEM终止消化，用200目的尼龙网过滤后，将滤液转移至新的50 ml离心管中，4℃，1 000 r/min 离心5 min，DMEM清洗2次，弃上清，用1 ml DMEM重悬细胞沉淀，计数板计数，按一定密度接种于新的60 mm细胞培养皿中，用含有10%FBS，1%P/S的DMEM传代培养1～2代。

1.2.2细胞因子检测 传代培养2代后，进行消化处理，重新按1×106个/ml接种到24孔板，细胞贴壁过夜。加入10 ng/ml、100 ng/ml或1 μg/ml LPS刺激，分别于0、6、12 h收取细胞培养基上清。参照说明书，利用CBA法检测IL-6的浓度，简述如下：取50 μl样本，用PBS稀释5倍，与含有2 μl 磁珠、2 μl PE和100 μl PBS混合后，室温避光孵育1.5 h，用PBS清洗1次，然后流式细胞仪检测。

1.2.3Western blot 分别接种ABRO1 KO和WT的MEF细胞于12孔板中，贴壁过夜，更换新的不含血清的DMEM饥饿3 h，用1 μg/ml LPS刺激0、15、30、60 min后，吸弃培养基，用PBS清洗1次后吸弃，每孔加入120 μl 2× loading buffer裂解细胞，收集于1.5 ml EP管中，将细胞裂解液样品沸水煮 15 min 后，每孔8 μl样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，4℃旋转孵育ABRO1、ACTB、p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK和JNK等抗体，孵育过夜，TBST洗3次，每次7 min，室温孵育二抗1 h，TBST洗3次，每次7 min，ECL法暗室显影检测相关通路蛋白。

1.2.4qPCR 提取ABRO1 KO和WT小鼠MEF细胞RNA：每个样品加1 ml TRIzol，反复吹打，摇床摇10 min，使蛋白与核酸完全分离；每个样品加入200 μl氯仿，振荡15 s，4℃，12 000 r/min离心15 min，把上层转移至新的RNase-free EP管中；加入同等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰上孵育30 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清，75%酒精洗涤沉淀；4℃，12 000 r/min离心5 min，吸弃上清，待乙醇完全挥发干净，加入50 μl无RNase水，使其充分溶解后，NanoDrop 2000测定RNA浓度和纯度，样本无明显杂峰，OD值在1.8～2.0之间即为合格样本。将RNA逆转录后，进行qPCR，检查溶解曲线、扩增曲线、CT值等，然后计算作图。PCR 引物序列：IL-6上游5′-GGCGGATCGGATGTT-GTGAT-3′;下游：5′-GGACCCCAGACAATCGGTTG-3′;TNF-α上游：5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′;下游：5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3′；IL-1β上游：5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′,下游：5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′;GAPDH 上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游 5′-TGT-AGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.5慢病毒包装制备和MEF细胞感染 为制备慢病毒颗粒，在10 cm细胞培养皿中培养293T细胞，用15 μg pCDH-NF-κB-Luciferase表达载体、10 μg psPAX2(Addgene)和5 μg pMD2.G(Addgene)进行转染，转染8 h后，更换为含10%FBS，1%P/S的DMEM培养基，再过40 h后，收集培养基上清，1 000 r/min 离心10 min，上清液通过0.45 μm膜过滤，预冷的PEG-it 病毒沉淀溶液(System Bioscien-ces，LV810A)加入到上清中，上清与PEG-it的混合液4℃条件过夜，4℃，1 650 r/min离心 30 min，去除沉淀，收集悬浮着慢病毒颗粒的上清液，10 μl等量分装储存于-80℃冰箱中。用制备好的慢病毒颗粒对MEF细胞进行感染。

1.2.6荧光素酶报告基因活性检测 吸弃感染荧光素酶报告基因的MEF细胞上清，加入被动裂解液，室温裂解15 min，收集细胞裂解液上清，转移至新的96孔板中，参照仪器和荧光素酶报告基因活性检测试剂盒说明书，用荧光检测仪检测荧光。计算报告基因与内参基因的荧光素酶活性比值，即荧光素酶活性。

1.3统计学处理 采用GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析，组间差异采用双侧t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1ABRO1敲除和WT小鼠MEF细胞的分离培养与表达鉴定 取孕期为13.5 d孕鼠胚胎，制备成ABRO1 KO和WT MEFs，Western blot鉴定MEF细胞，证实ABRO1 KO MEF细胞中无ABRO1表达，而WT MEF细胞中ABRO1正常表达(图1)。说明ABRO1 KO和WT MEF细胞构建成功。

图1 MEFs细胞中ABRO1蛋白表达鉴定

2.2敲除ABRO1不影响MEF细胞中LPS诱导的IL-6释放 传代2次后的MEF细胞重新消化，种板，分别用10 ng/ml、100 ng/ml和1 μg/ml 3种剂量的LPS刺激MEF细胞0、6、12 h，收取细胞培养基上清，流式CBA法检测炎症因子IL-6的含量，结果显示，静息态MEF细胞分泌极少量IL-6，而LPS刺激6 h或12 h可以促进IL-6的大量分泌；但是，无论在何种刺激浓度和刺激时间下，ABRO1 KO和WT MEF细胞产生的IL-6水平都基本一致(图2A～C)。

图2 敲除ABRO1不影响MEF细胞中LPS诱导的IL-6的释放

2.3敲除ABRO1不影响MEF细胞中LPS诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平 1 μg/ml LPS刺激MEF细胞0 h和3 h，收集细胞提取RNA，用qPCR检测IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平。结果显示，LPS刺激3 h显著提高了IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平，但ABRO1 KO和WT MEF细胞中这3种细胞因子的mRNA水平基本一致(图3A～C)。

图3 敲除ABRO1不影响MEFs细胞中LPS诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平

2.4敲除ABRO1不影响MEF细胞中LPS-TLR4信号通路的活化 进一步检测了敲除ABRO1对TLR4下游信号通路活化的影响，主要包括NF-κB和MAPK信号通路。Western blot结果显示，LPS刺激后MEF细胞IκBα蛋白水平迅速降低，在之后60 min 恢复到较高水平；p-IκBα和p-P38在15 min和60 min出现2次表达峰；但ABRO1敲除并不影响IκBα降解以及P65、IκBα、P38、ERK、JNK磷酸化水平的动态变化(图4)。

图4 敲除ABRO1不影响MEF细胞LPS/TLR4信号通路的活化

2.5敲除ABRO1不影响MEF细胞中NF-κB报告基因活性 利用慢病毒将NF-κB报告基因转入到MEF细胞中，1 μg/ml LPS分别刺激0、3、6 h，结果显示，LPS刺激显著提高NF-κB报告基因活性，但ABRO1 KO和WT的MEF细胞中NF-κB报告基因的活性无显著差异(图5)。

3 讨论

本研究重点揭示了敲除ABRO1对MEF细胞LPS/TLR4通路活化的影响。结果显示，缺失ABRO1并不影响MEF细胞中LPS诱导的IL-6的分泌及IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平；ABRO1 KO MEF细胞中，LPS诱导的TLR4下游NF-κB和MAPK信号通路的活化并无明显异常；敲除ABRO1也并不影响LPS对NF-κB报告基因的激活。因此，敲除ABRO1不影响MEF细胞中LPS/TLR4通路的活化。LPS/TLR4通路活化后会激活多种转录因子，其中NF-κB最为关键。正常情况下NF-κB/P65被IκBα限制在胞质，LPS刺激促进IκBα磷酸化，进而IκBα发生降解，释放NF-κB，NF-κB入核后与目的基因特异性结合并使其转录[9]。类似NF-κB通路，LPS/TLR4活化也会促进ERK、JNK和P38发生磷酸化，激活相关核蛋白和转录因子，如AP1等[10]。IL-6等炎症细胞因子是转录因子NF-κB所调控的靶基因，在LPS/TLR4介导的炎症反应及相关疾病中起关键作用[11-12]。本研究重点检测了ABRO1 KO及WT MEF细胞中NF-κB和MAPK信号通路的活化、NF-κB报告基因的活性、炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的转录以及IL-6的分泌，以探讨ABRO1对MEF细胞LPS/TLR4通路的影响。

已有研究表明，BRISC在免疫反应中发挥着重要作用。BRISC可以调节Ⅰ型干扰素受体IFNAR1的去泛素化并促进其活化，进而参与抗病毒反应[13]。BRISC也可以调节NLRP3去泛素化，进而促进NLRP3炎症小体活化[7]。BRISC还可以通过调节HIV-1病毒Tat蛋白K63位去泛素化，控制其自噬途径的降解[14]。在小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中，敲除ABRO1和BRCC3并不影响LPS/TLR4信号通路的活化[15]。但是LPS处理后的ABRO1敲除小鼠外周血单个核细胞中，IL-1β和IFN-β等细胞因子的mRNA水平明显降低，提示敲除ABRO1可能抑制了某些细胞中LPS/TLR4通路的活化[13]。MEF细胞是研究天然免疫的重要材料，MEF细胞并不是发挥免疫功能的细胞，只有在外界刺激下才产生应答并分泌炎症因子或化学因子等，分泌细胞因子的能力强，MEF细胞的分离比分离纯化免疫细胞更方便，MEF细胞属于贴壁培养细胞，而大多数免疫细胞属于悬浮细胞，因此选用MEF细胞实验过程更容易控制[16]。目前MEF是研究天然免疫过程中某个基因或信号通路较佳的细胞模型[8]。而ABRO1在小鼠MEF细胞中的功能研究尚未报道。我们分离了ABRO1 KO和WT MEF细胞，建立了LPS诱导小鼠MEF细胞炎症模型，发现ABRO1敲除并不影响LPS诱导的炎症细胞因子IL-6的分泌以及TLR4下游NF-κB和MAPK信号通路的活化。说明ABRO1对LPS/TLR4通路的影响可能具有细胞特异性，需要后续进一步确定。