尼莫地平调节PI3K/AKT通路对人结肠癌SW480细胞生长和运动能力的抑制作用①

刘 霄 杨 姝 陈 敏

(遵义医学院附属医院腹部肿瘤科，遵义 563000)

结肠癌是发病率排名前三的胃肠道恶性肿瘤，易发病于40～50岁人群，近年来其发病呈年轻化趋势[1]。目前，结肠癌的治疗以减少复发率和提高生存率为主要目标，主要手段包括手术、化疗和放疗等综合治疗；近年研究表明，非甾体类抗炎药可预防消化道肿瘤的产生，与抑制肿瘤细胞生长有关[1-2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)能活化AKT，参与调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种信号传导。尼莫地平(Nimodipine，Nim，C21H26N207)是第二代1,4-二氢吡啶钙通道阻滞剂，能通过阻断非活性构象的L型钙通道避免钙离子大量涌入，从而防治血管收缩，具有亲脂性，能穿越血脑屏障，因此主要应用于蛛网膜下腔出血后的血管痉挛的治疗[3]。此外，研究表明，Nim还具有神经保护作用，在许多耳鼻咽病的治疗中发挥作用[4]。有研究表明，PI3K/AKT信号通路与脑血管病变相关的认知功能下降有关，双侧颈总动脉闭塞(2VO)模型大鼠经Nim治疗4周后，PI3K/AKT通路相关蛋白明显上调，脑损伤也显著减轻[5]。另外，研究发现，PI3K/AKT信号转导是调控癌症治疗的新途径，该通路参与了前列腺癌细胞的细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭，而Ras抑制剂能通过该通路过抑制SW480细胞的增殖和转移[6-7]。但Nim能否通过PI3K/AKT通路对结肠癌细胞产生影响还未见报道。因此，本文以体外培养的SW480细胞为研究对象，研究Nim对人结肠癌SW480细胞生长和运动能力的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源 人结肠癌细胞株SW480购自北京中科院肿瘤细胞库。

1.1.2主要试剂 RPMI1640培养液、胎牛血清、0.25%胰酶购自美国赛默飞世尔公司；DMSO购自上海生工；Nim(纯度≥98%)、RIPA裂解液购自美国Sigma公司，Nim用DMSO和无血清培养基溶解配制；Transwell小室购自北京优尼康生物技术有限公司；Matrix基质胶购自美国BD公司；BCA试剂盒购自南京碧云天生物科技公司；单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自Abcam公司。

1.1.3主要仪器 3111 CO2恒温培养箱购自美国Thermo Forma公司；TDL-5-A离心机购自中国上海第一医学院仪器厂；FACS AriaⅡ 流式细胞仪购自美国BD公司；CW-CJ-2F超净工作台购自苏州净化设备有限公司；电泳仪和半干转膜仪购自美国伯乐公司；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司；普通光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基将人结肠癌SW480细胞培养于37℃、5% CO2的恒温培养箱中。镜下观察细胞生长状态，细胞融合率达80%以上时可传代。

1.2.2CCK8实验 将人结肠癌SW480细胞以2×104个/ml接种于96孔板，每孔加入100 μl，待细胞贴壁后，随机分为4组：Control(对照)组、Nim 10、20和50 μmol/L组，分别给予对应终浓度Nim，每个剂量组设6个复孔；再设置4个亚组，分别在上述操作后继续培养24、48、72和96 h，之后每孔加入10 μl CCK8溶液，继续孵育4 h。450 nm吸光度于酶标仪测定各组人结肠癌SW480细胞增殖。

1.2.3流式细胞术 以1×105个/ml将人结肠癌SW480细胞接种于6孔板，待细胞融合率达80%以上时用胰酶收集细胞，调整密度为1×106个/ml。严格按照FITC-Annexin V试剂盒说明书，每个样本加入5 μl的FITC-Annexin V和PI染色液，室温避光孵育15 min后上机检测。

1.2.4Transwell实验 以1×105个/ml将人结肠癌SW480细胞接种于6孔板，待细胞融合率达80%以上时，加入1.2.2所述浓度药物处理24 h。胰酶收集细胞，调整密度为1×105个/ml，接种于提前用Matrigel基质胶包被好的Transwell小室上层，加入不含胎牛血清的培养液，小室下层加入含胎牛血清的培养液。培养24 h后，无菌拭去Matrigel基质胶和小室上层细胞，PBS洗涤3次，4 %多聚甲醛固定，结晶紫染色细胞，流水冲洗后自然晾干。镜下随机选取5个视野计数。实验至少重复3次，设6个复孔。

1.2.5划痕实验 用记号笔在12孔板背面画出5条平行直线，灭菌备用。以1×105个/ml将人结肠癌SW480细胞接种于灭菌的12孔板。待细胞贴壁后，加入无血清培养基和5 μg/ml丝裂霉素C培养12 h以抑制细胞增殖[8]。再用10 μl枪头垂直于记号笔横线划痕，PBS清洗3次。将细胞随机分为4组，分别为Control(对照)组、Nim 10、20和50 μmol/L组，给予对应终浓度药液处理后继续培养24 h。随机选取5个视野观察并拍照。

1.2.6Western blot实验 用RIPA蛋白裂解液于冰上裂解提取各组细胞总蛋白，4℃离心后取上清用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。弃一抗，清洗后加入对应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光显影，以β-actin为内参。

1.2.7740Y-P对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响 加入PI3K激活剂740Y-P，将SW480细胞随机分为4组：Control组、Nim50 μmol/L组、740Y-P组和740Y-P+Nim 50 μmol/L组。CCK8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell检测细胞侵袭能力，Western blot 检测Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。

2 结果

2.1Nim对体外培养SW480细胞增殖的影响 CCK8法检测人结肠癌SW480细胞增殖结果显示，与对照组相比，处理后SW480细胞增殖均明显降低，组间差异有统计学意义(F=42.04，P<0.001，图1)，且SW480细胞增殖与Nim处理浓度呈负相关。提示Nim对人结肠癌SW480细胞增殖活性的抑制作用具有剂量依赖性。

图1 CCK8法检测人结肠癌SW480细胞增殖

2.2Nim对体外培养SW480细胞凋亡的影响 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况结果表明，与对照组相比，随着Nim给药浓度增大，10、20和50 μmol/L Nim处理组SW480细胞凋亡率增加(F=85.82，P<0.001，图2)。提示Nim能剂量依赖性地增加体外培养SW480细胞的凋亡率。

图2 流式检测细胞凋亡

2.3Nim对体外培养SW480细胞侵袭能力的影响 Transwell检测SW480细胞侵袭能力结果显示，与对照组相比，经Nim处理后各给药组镜下观察侵袭细胞数量明显减少(F=85.09，P<0.001，图3)，且Nim浓度越大，侵袭细胞数越少。提示Nim能剂量依赖性地降低SW480细胞的侵袭能力。

图3 Transwell检测细胞侵袭能力(×400)

2.4Nim对体外培养SW480细胞迁移能力的影响 划痕实验检测Nim对SW480细胞迁移能力的影响结果显示，与对照组相比，经Nim处理24 h后各剂量组划痕愈合率随Nim浓度增大而明显降低(F=44.00，P<0.001，图4)。提示Nim能有效抑制体外培养SW480细胞的转移能力，且抑制作用与处理浓度呈正相关。

图4 划痕实验检测细胞迁移能力(×200)

2.5Nim对体外培养SW480细胞生长和运动相关蛋白表达的影响 Western blot检测SW480细胞生长和运动相关蛋白的表达情况结果如图5所示，与对照组相比，Nim 10、20和50 μmol/L组细胞Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平均被抑制，组间差异均具有统计学意义，F值分别为82.54、78.55和72.94，P均<0.001，且这种抑制作用与Nim浓度呈正比；与对照组相比，各剂量组cl-caspase-3的表达水平明显上调，且与Nim浓度呈正相关，差异有统计学意义(F=62.19,P<0.001)。以上结果表明，在体外培养的SW480细胞中，Nim能剂量依赖性地促进cl-caspase-3表达，抑制Ki67、MMP-2和MMP-9表达，从而抑制SW480的体外生长和运动。

图5 SW480细胞生长和运动相关蛋白的表达

2.6Nim对体外培养SW480细胞信号通路的影响Western blot检测SW480细胞信号通路相关蛋白的表达情况结果如图6所示，与对照组相比，各Nim处理组细胞p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达水平被明显抑制，F值分别为61.04和42.92，P均<0.001，且这种抑制作用与Nim浓度呈正比。提示Nim能剂量依赖性地抑制p-PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达，从而影响PI3K/AKT信号通路。

图6 Western blot检测SW480细胞信号通路相关蛋白的表达

2.7Nim、740Y-P单用/联用对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响 用50 μmol/L Nim和PI3K激活剂740Y-P单独或共处理SW480细胞，检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力，结果表明，与对照组相比，单独使用Nim或740Y-P可分别显著降低或增加SW480细胞的增殖(F=10.25，P=0.008)，而两者共处理时，SW480细胞的增殖较740Y-P单用时也显著降低(P<0.01)，见图7A；如图7B，单独使用50 μmol/L Nim或740Y-P处理较对照组可显著增加或降低SW480细胞的凋亡率(F=23.36，P=0.005)，而与单用740Y-P相比，两者联合使用可增加细胞凋亡率(F=35.10，P=0.007)；与对照组相比，单用50 μmol/L Nim或740Y-P能显著抑制或增加侵袭细胞数和划痕愈合率(F=31.69，P<0.001)，而两者联用较单用740Y-P可显著降低侵袭细胞数和划痕愈合率(F=56.22，P<0.001，图7C、D)；与对照组相比，单用Nim处理SW480细胞能抑制Ki67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达，促进cl-caspase-3蛋白表达(F=15.02，P=0.001)，单用740Y-P作用则刚好相反(F=8.69，P=0.006，如图7E)，但与之相比，两者联用可有效逆转单用740Y-P对上述蛋白表达的影响(F=27.36，P<0.001)。

图7 Nim与740Y-P共处理对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力影响

以上结果表明，Nim能有效逆转PI3K激活剂740Y-P对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。

3 讨论

随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，结肠癌发病率呈逐年上升趋势，且越来越年轻化。癌症的发病机制尚未被完全阐明，主要表现为对抗生长抑制信号、无限增殖、凋亡抵抗、异常代谢(如Warburg效应)等[9]。PI3K/AKT通路的异常激活常与细胞转化、肿瘤发生、癌症发展及药物耐药性有关，因此临床上有许多靶向该通路的药物单独或联用于实体瘤和血液恶性肿瘤的治疗，如激活PI3K/AKT通路能诱导结肠癌SW480细胞对顺铂的耐药性[10-11]。研究发现，Nim通过上调PI3K/AKT通路相关蛋白能有效改善2VO模型大鼠的脑损伤和学习记忆能力[5]。因此，本文针对体外培养的人结肠癌SW480细胞研究Nim能否通过PI3K/AKT通路对SW480细胞产生影响。

细胞异常增殖和凋亡抑制是肿瘤发生的重要特点，因此抑制其增殖和促进其凋亡发生是抗癌药开发的重要思路。体内和体外实验表明，益智油(高良姜石油醚馏分)通过上调PTEN表达、下调PI3K表达、抑制AKT磷酸化诱导细胞凋亡而对肝癌HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和Hep3B细胞的生长呈浓度和时间依赖性抑制[12]。EG-VEGF是一种来自内分泌腺体的血管内皮生长因子，研究发现，EG-VEGF沉默能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胰腺癌PC细胞增殖，促进细胞凋亡发生[13]。另有研究认为，LINC01133作为一种长链非编码RNA，在多种肿瘤中高表达，敲除LINC01133后能对肝癌HCC细胞增殖产生抑制作用[14]。本文研究发现，Nim处理SW480细胞后，能下调增殖相关蛋白Ki67表达，上调凋亡相关蛋白cl-caspase-3表达，从而抑制SW480细胞增殖，诱导其凋亡。

抑制肿瘤细胞侵袭和转移是抗癌药的又一重要靶点。MMPs是一类蛋白水解酶，在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用；MMP-2和MMP-9的高表达与多种肿瘤的不良预后有关[15]。研究表明，决明子蒽酮-C-糖苷、决明子苷在结肠癌荷瘤小鼠体内起抗肿瘤和抗转移作用，其主要机制与抑制VEGF和MMP-9表达及VEGFR-2磷酸化等有关[16]。五味子乙素则能抑制p-AKT、p-mTOR和MMP-9表达，从而剂量依赖性地抑制恶性胶质瘤细胞系U251和U87细胞的迁移和侵袭[17]。Ras抑制剂通过抑制Ras-PI3K-AKT-HIF-1α途径下调赖氨酰氧化酶而显示出对人结肠癌细胞SW480的抗转移作用[7]。RNA螺旋酶DHX33是调节一系列参与细胞周期和细胞迁移的关键基因，其敲除可导致体内和体外胶质母细胞瘤细胞增殖和迁移，其产生可被PI3K和mTOR抑制剂诱导[18]。本研究也表明，Nim能有效下调MMP-2和MMP-9蛋白在SW480细胞中的表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。

PI3K隶属于磷脂激酶家族，机体内多种生长因子均能激活PI3K而产生第二信使PIP3，进而结合活化含有PH结构域的苏氨酸激酶AKT，参与调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种信号传导。大量研究表明，包括癌症在内的多种疾病的发生发展都可能与该通路的异常激活相关，如卵巢癌，宫颈癌，肝癌[12,19-21]。研究发现，在慢性阻塞性肺病(COPD)中，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)高表达通过激活EGFR/PI3K/AKT通路上调炎症因子表达水平加重COPD的病理改变[22]。研究表明，沉默促凋亡p53蛋白2(apoptosis-stimulating p53 protein 2,ASPP2)后，能通过PI3K/AKT通路影响三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力[23]。另有研究证明，通过调节PI3K/AKT信号通路，长非编码RNA PlncRNA-1可促进大肠癌细胞的进展，而PlncRNA-1基因敲除可显著抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，同时促进其凋亡[24]。苦参碱(oxymatrine,OMT)和/或奥沙利铂(OXA)处理结肠癌细胞系HT29和SW480结果表明二者均具有抑制结肠癌细胞增殖的作用，且具有协同作用。另外，二者联用还能通过降低PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达诱导结肠癌细胞发生凋亡[25]。本研究也证实，PI3K/AKT信号通路是Nim抑制SW480细胞生长和运动能力的作用机制。

本研究认为，Nim能抑制体外培养的SW480细胞增殖、侵袭和迁移，促进其凋亡，影响凋亡相关分子cl-caspase-3、增殖相关蛋白Ki67、MMP-2、MMP-9及信号通路相关蛋白p-PI3K和p-AKT/AKT的表达水平；还能在单用或与PI3K激活剂740Y-P联用时表现出对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的抑制作用。综上所述，Nim能通过调节PI3K/AKT信号通路实现对人结肠癌SW480细胞生长和运动能力的抑制作用。因此，Nim可能是一种潜在的治疗结肠癌的药物。