染色体分选技术在植物学研究中的应用

钱旺, 王秋松, 杨善,2, 徐良年,3,4*, 邓祖湖,2,4*

染色体分选技术在植物学研究中的应用

钱旺1, 王秋松1, 杨善1,2, 徐良年1,3,4*, 邓祖湖1,2,4*

(1. 福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福州 350002；2. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004; 3. 广西甘蔗生物学重点实验室，南宁 530004; 4. 农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福州 350002)

介绍了染色体分选技术的基本原理和样品处理的基本流程，对根尖分生区采用同步化处理，制备染色体悬浮液，最后通过流式细胞仪的分析与收集获得纯度高、数量多的目标染色体。综述了染色体分选技术在植物学研究中的主要应用，包括物理图谱的构建、DNA分子标记的开发、以及复杂多倍体植物的基因组测序等。通过染色体分选技术的不断完善与发展, 应用于染色体分选的探针标记不断开发，以及分选后的染色体DNA纯化和扩增技术的优化，将为多倍体植物如甘蔗等基因组学研究提供更有效的帮助。

染色体分选；流式细胞术；基因组；多倍体植物

染色体分选技术是一种基于流式细胞仪在经细胞周期同步化富集中期染色体的悬浮液中快速分析、分选染色体的有效手段[1]。起初，在人类基因组计划方面研究比较多[2]，在植物方面研究很少。随着高质量的植物染色体悬浮液的成功制备，植物染色体分选技术的研究获得了快速发展[3]。国外在染色体分选方面的研究报道较多，特别是捷克、美国、澳大利亚等国家, 而国内鲜有报道。国际小麦基因组测序联盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC)提出将小麦基因组分离为染色体或染色体臂组成，并构建相应的BAC文库[4]。后续BAC测序和物理图谱的构建由IWGSC成员国分担，我国主要是负责7DL物理图谱构建。通过这种“化整为零”的方法，IWGSC完成了小麦染色体的物理作图，并使基因组测序得以完成[5]。受此鼓舞，染色体分选技术在复杂基因组植物中的应用越来越广泛。通过对基因组中各条染色体的分选来完成全基因组的测序，不仅解决了组装困难的问题，而且可以进一步研究基因组的结构和进化，并且可以分离出感兴趣的一条或多条染色体进行精细研究。染色体的分离使得我们可以用感兴趣的基因分析染色体，例如，由于小麦基因组的高度复杂性和多倍体性阻碍了基因定位的克隆和靶标记的开发。通过对分选得到的小麦7A、7B和7D染色体的精细研究，最终从小麦染色体臂7DS上成功克隆了俄罗斯小麦抗蚜虫基因Dn2401并开发出11个新的与基因相关的标记[6]。自然界中高等植物的多倍化现象较为普遍，对其全基因组测序和组装还存在困难，因此采用染色体分选技术是一种不错的选择。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)作为分子生物学应用最广、最普遍的细胞定量分析技术, 具有精确、高效的优点，是根据液体悬浮液细胞或其他生物大分子的理化性质与光学参数进行功能水平上的精确收集与分析，从而实现对目标颗粒群体进行快速、准确的分析和分选[7]。早期流式细胞术在植物染色体分选中采用的是单色标记，即只用一种荧光标记物标记悬浮液中的染色体，这样染色体的大小可用荧光信号值的强弱来表示，这种荧光信号最终在计算机上表现为数值的大小，形态大小相近的染色体聚集在一起就形成峰或点，不同的染色体因自身的长短、形态而聚集成不同的峰或点，从而达到分选染色体的目的。但是这种分选方式要求被分选的植物染色体形态必须差异大，然而，大多数植物的染色体间形态往往差异没那么大，因此采用单色标记法常常难以分选到感兴趣的染色体。使染色体分选技术得到迅速发展的原因是悬浮液荧光原位杂交技术与染色体分选的结合。研究人员通过设计探针，给目标染色体标记荧光信号，从而能够分选感兴趣的染色体进行研究。这种利用双色标记进行流式核型分析的方法在植物染色体分析中发挥了强大的优势，对完成小麦基因组测序工作发挥重要作用[5]。目前，流式细胞术在植物染色体上的应用不仅体现在流式核型分析方面，也表现在目标染色体物理图谱的构建、遗传学标记的开发以及染色体测序等相关研究。

1 流式细胞术染色体分选的基本原理

流式细胞术是根据细胞理化性质，对悬浮液中的细胞群体进行快速、准确地分析与分选。早期其主要应用于动物细胞研究，而在植物细胞学研究的应用较晚，原因是植物细胞结构与动物细胞不同, 具有细胞壁和特殊的细胞器，制备单细胞悬浮液比较困难。流式细胞术广泛应用于DNA含量、检测细胞凋亡、植物细胞周期、染色体核型和流式分子表型分析等方面研究分析[8–9]。流式细胞术分选染色体的基本原理是把经细胞周期同步化后的根尖组织进行酶解或进行机械匀浆，制成染色体悬浮液，在其中加入荧光标记探针与靶染色体进行杂交，制成荧光染色体悬浮液。然后，将其加入到流式细胞仪中，在鞘液带动下高速通过光学检测系统，流式细胞仪中荧光信号的相对强度表现为染色体的含量。通过流式细胞仪可以将荧光标记的染色体信息可视化地表现在电脑上，结果可以用染色体分布的一维直方图或二维散点图表示(分别是柱状图或散点图)。在一维直方图中，不同的染色体在分布范围内形成不一样的峰值，每种峰值都代表一种染色体大小的差异；而在二维散点图中，不同的染色体形成不同的簇。通过染色体DNA含量和碱基对特异性荧光色素检测到的A-T/G-C含量差异将其分开。然后，通过调节分选参数，流式细胞仪可以自动对不同染色体峰或形成的簇进行分类，收集分选出的单一类型染色体。

2 染色体分选样品的处理

染色体分选技术包括细胞同步化处理，染色体悬浮液制备以及利用流式细胞仪对分选染色体的流式核型分析、分选和收集，最后得到分选出的染色体。

2.1 制备植物染色体的材料选取

植物细胞周期同步化的材料主要来源于叶肉原生质体或根尖分生组织的悬浮培养细胞。细胞悬浮培养具有生长迅速、便于处理等优点，已在胡萝卜()、烟草()、小麦()等植物的悬浮细胞培养中成功进行同步化诱导。1984年De Laat等[10]以同步化诱导后的纤细单冠菊()的悬浮培养细胞为材料，完成了植物染色体的首次流式核型分析。但是悬浮液培养细胞存在缺点，即建立一个悬浮培养体系耗时多，需要数月甚至数年时间，并且核型的稳定性差，不利于遗传研究与利用。因此研究人员尝试通过培养植物叶肉原生质体来获得染色体，1987年Conia等[11]以矮牵牛()的叶肉原生质体进行同步化诱导，但是这种方法富集的中期指数只有10%。并且由于植物叶肉原生质体难获得，培养体系难构建，叶肉原生质体方法并没有得到广泛的运用。1992年Dolezel等[3]成功利用蚕豆()的根尖分生组织制备了高质量的染色体悬浮液。Halfmann等的研究表明，生长活跃的植物根尖分生组织中细胞群体分裂旺盛，并保持恒定的循环周期，易于进行人为同步化调控处理[12]。由于植物根尖具有来源广、易处理、可重复以及稳定性高等优点，通过使用植物根尖材料实现了多种植物的中期染色体富集的研究，如小麦[13]、豌豆()[14]、棉花()[12]和甘蔗()[15]等。

2.2 细胞周期同步化富集中期染色体

根尖是制备染色体悬浮液，实现染色体分选的理想材料。然而，未经处理的植物根尖材料用于制备染色体悬浮液的效果并不理想。在自然条件下生长的根尖分生组织细胞中，处于分裂期的细胞仅占整个分生区细胞的5%~8%[16]，用其制备的染色体悬浮液中包含大量细胞核以及细胞杂质。在进行染色体分选时，过多的核以及杂质会干扰染色体的识别，导致分选效率低下、误差大。因此，在进行染色体悬浮液的制备前，首先进行细胞周期同步化处理，即通过低温、DNA合成抑制剂和微管抑制剂等理化措施对根尖分生组织细胞进行处理，使其大部分细胞处于有丝分裂的中期，从而获得以中期染色体为主的流式核型[17]。

植物组织中细胞周期同步化诱导主要有两种策略：即物理法与化学法诱导。物理法是根据细胞的物理特征将细胞同步化，常用的有离心淘析法(centrifugal elutriation)，即利用细胞在不同时期的大小不相同的特点，通过离心方式对目标阶段的细胞进行分离与收集，以获得同步化的群体[18]。虽然这种方法操作简单，但是需要的实验设备特殊且昂贵，因此应用并不广泛。化学法则在细胞的不同阶段采用不同类型的化学抑制剂处理，以达到对特定细胞周期的关键响应因子进行功能抑制，使细胞分裂过程受阻停滞在某一阶段，从而达到富集某一目标时期的细胞群体的目的。在去除抑制后，细胞会继续向下一个阶段前进。通常采用不同类型的化学抑制剂对细胞生长周期进行人为调控，主要分为两种，一种是DNA合成抑制剂，通过抑制周期蛋白(cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclins depen- dent kinases, CDKs)的有效表达，使细胞暂时抑制DNA的复制，停留在G1/S阶段，如羟基脲(HU)、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷等均可以抑制DNA的合成，去除DNA合成抑制剂后细胞可恢复正常进程。第二种是微管抑制剂，通过破坏有丝分裂中微管的形成，消除纺锤体的牵引力从而将细胞阻断在中期，达到富集中期染色体的目的，如甲基胺草磷(amiprophos-methyl, APM)、氟乐灵(trifluralin)以及秋水仙碱(colchicine)等。由于不同植物的生长周期不同，为达到理想效果，对细胞的同步化处理也应调整优化。而为了提高细胞周期同步化效率，通常会将两种类型的抑制剂组合使用。早在1999年，Dolezel等[13]就通过对HU和APM进行组合，对蚕豆根尖进行同步化处理，获得的中期指数最高可达70%。在大麦()根尖细胞周期同步化中，Lee等[16]通过组合使用HU与氟乐灵，获得的染色体中期指数高达76.5%。

2.3 染色体悬浮液的制备

受染色体悬浮液制备质量的限制，植物染色体分选研究进展缓慢。高等植物细胞具有细胞壁，细胞壁对染色体的分离造成了一定的困难。要获得完整的染色体，必须先去除细胞壁的束缚。有两种方法从植物体细胞中释放染色体：一种是酶解法，通过混合酶液(纤维素酶与果胶酶等)的酶解处理，可以去除细胞壁，但这种方法操作过程繁琐，而且酶解后产生的大量细胞碎片不利于直接进行流式分析[10]；第二种是机械破碎法，也是现在主流的制备染色体悬浮液的方法。将同步化处理后的根尖细胞用甲醛溶液固定，用超高转速破碎细胞壁使染色体释放出来，然后用50m孔径滤膜过滤细胞碎片。机械破碎法对染色体损伤小，且悬浮液中细胞碎片含量减少，可提高分选染色体的纯度[3]。进一步的研究表明，对经机械破碎后的染色体悬浮液采用蔗糖梯度的方法进行纯化，可以使染色体悬浮液中的细胞碎片及杂质含量更低，染色体形态结构更完整，背景更加清晰[19]。

多种因素都会影响到制备的染色体悬浮液质量。其中，固定液种类和固定时间对染色体形态的影响都很大。因而有不少关于对甲醛固定液浓度和固定时间进行优化的研究，以期获得高质量的染色体悬浮液。如Lee等[20]对大麦根尖细胞同步化，在获得76.5%的中期染色体指数基础上，采用2%的甲醛固定20 min，机械匀浆后获得了高质量的细胞悬浮液；同样地，对所获得的70%的中期染色体指数的玉米根尖用3%的甲醛固定25 min后机械匀浆,也获得高质量的悬浮液[21]，为后续研究奠定了基础。染色体悬浮液的裂解缓冲液的选择也很重要, 裂解缓冲液影响染色体的形态稳定性，用裂解缓冲液可以使悬浮液中的染色体处于独立稳定的形态而不聚集和沉淀，利于分选染色体。常用的裂解液有LB01、MgSO4、WPB、Otto’s等[22]，不同植物适用的裂解液也可能不同。因为染色体悬浮液的质量对染色体分选至关重要，因此在对一种植物进行染色体分选前，对甲醛固定液的浓度、固定时间和裂解缓冲液进行优化筛选很有必要。

3 染色体分选技术在植物学研究中的应用

双色荧光信号标记的应用使染色体分选技术得到进一步发展，分子标记与目标染色体结合可以帮助研究者实现分选目标染色体的愿望。由于它能够按照研究人员意愿分离到数量较多的纯度极高的特定染色体而得到广泛应用。所分选的高纯度染色体或片段极大地简化了植物复杂基因组的分析, 并为物理图谱构建、遗传学标记开发以及基因定位等方面的研究提供帮助。而基于染色体技术进行基因组学的研究分析被称为染色体基因组学。流式分选染色体的主要用途随着细胞学、分子生物学和基因组学方法的发展而不断扩大。

3.1 构建物理图谱

基于流式细胞仪的染色体分选技术可以分选出目标的染色体，用来构建染色体的BAC文库[23]。被流式细胞术分选出来的染色体本身就包含基因组的部分独立的DNA序列，因此研究者可以将分选出的染色体作为模板来定位基因或遗传标记在染色体中的位置，从而构建分选染色体的物理图谱和遗传图谱。通过这种方法研究者已将球蛋白基因绘制到豌豆的基因图谱上[24]。之前，由于等位基因的缺失变异，这些基因难以绘制到基因图谱中。利用分选出的在蚕豆和豌豆中相互易位的染色体, Macas[24]和Neumann[25]将大量DNA序列定位到它们的亚染色体区域。Simkova[26]用分选出的面包小麦的7D染色体分别构建了7DL和7DS染色体的BAC文库。对于7DS文库，利用俄罗斯小麦蚜虫抗性基因DnCI2401相关的标记物筛选，获得包含抗性基因DnCI2401的克隆片段；而7DL文库采用与绿盲蝽抗性基因相关的探针杂交筛选，获得包含的克隆片段。由于分选得到的面包小麦7D染色体的克隆相对于基因组的克隆数目少，所以筛选效率高，成本低。Zatloukalová等[27]对流式细胞术分选出的鹰嘴豆()染色体进行染色体核型研究，最终将物理图谱与遗传图谱整合，并开发出一套有效的细胞遗传标记物，其中2个分子标记可以鉴别染色体E和H。Roberto等[28]利用染色体形态差异并结合5s与45s在染色体中的定位对芦笋进行染色体分选，发现有4种染色体(IV、V、VI和VIII)可以被区分和分选；然后，利用72个SSR标记对流式核型上单个峰的染色体含量进行了鉴定，其中27个被纳入遗传连锁图谱，并将遗传连锁群联系到染色体上，同时发现性别决定位点位于LG5上，其与V峰相关，V峰代表了一个带有5S rDNA位点的染色体。

3.2 DNA标记的开发

通过分选出单个染色体可以降低模板的复杂性，有利于遗传标记的开发。标记是构建遗传连锁图谱、基因定位、组装物理图谱以及图位克隆的重要资源。在植物遗传学中应用最广泛的标记是SSRs、DArTs (多样性微阵列技术)、ISBPs (基于插入位点的多态性)和SNPs (单核苷酸多态性)。通过分选染色体构建染色体的特异文库，开发DNA分子标记是一种有效的途径。DNA标记既可从短插入染色体特异文库中获得[29]，也可以从长插入染色体特异文库中获得[30]。DArTs标记的开发不需要构建染色体特异文库，可直接从分选染色体纯化后的DNA中开发得到。Wenzl等[31]从分选的小麦3B染色体和1B染色体短臂分别获得了510和59个DArTs标记，而该方法的效率明显大幅提高，只筛选了2 688个小麦3B染色体的克隆就获得了510个标记，然而筛选整个基因组大约70 000个克隆才获得了269个标记。利用染色体分选技术与测序技术结合可以开发大量的染色体特异性标记，Shatalina等[32]利用分选出的2个六倍体冬小麦Arina和Forno的3B染色体测序开发出70多个SNPs标记。

3.3 基因组测序

随着测序技术的不断发展，越来越多植物的基因组序列及组成被人们破解，为基因组学研究提供了基础。然而对于一些基因组信息庞大、富含高度冗余序列的多倍体植物来说仍然存在测序和组装困难以及测序成本高的问题。但是染色体分选技术的出现使得研究人员可以将植物体复杂的基因组拆分为染色体组，通过分选单条染色体或染色体臂进行深入研究，解决了多倍体植物测序和组装困难的问题。国际小麦基因组测序联盟为了测定小麦的全基因组序列，提出了染色体逐条测序的方法，利用流式分选技术对中国春小麦的21条染色体进行分离，并构建了相应的BAC文库为基因组测序提供帮助。Jin等[33]利用流式细胞术对簇毛麦染色体4VS进行了分选，并利用Illumina平台进行测序获得大约170.6 Mb的组装序列；该序列为小麦黄花叶病毒抗性基因Wss1的定位和图位克隆提供了有价值的信息。Akpinar等[34]报道了利用流式分选染色体技术分选出野生二粒小麦的5B染色体，然后进行测序，通过研究蛋白编码基因、重复元件和假定的microRNA和tRNA编码序列，揭示其基因组的结构、组织和功能，助力小麦的遗传改良。Miao等[35]对六倍体小麦‘CRNIL1A’的3B染色体进行分选并测序，报道中国春小麦3B染色体上缺失的CRNIL1A序列约为8.3 Mb，与中国春小麦基因组序列进行比对，大约有159.3 Mb的序列不存在于‘中国春’的基因组中。把来自不同地理起源的226份普通小麦的序列与‘CRNIL1A’特异序列进行比较，结果表明部分序列只存在于特定区域的小麦基因型中, 表明具有这些序列的品种分布存在地域差异性，可能与小麦的适应性选择有一定关系。

现代甘蔗栽培品种主要由热带种和细茎野生种杂交而来,为异源多倍体，染色体倍性变化大(可多达16倍以上)，基因组组成复杂[36]；目前对甘蔗栽培种基因组的研究较少，2018年Garsmeur等[37]用PacBio RS II测序平台对甘蔗R570构建的BAC文库进行一一测序，由此构建了只有基因富集区域序列的1个仅为370 Mb的简单甘蔗基因组。2018年Zhang等[38]完成了对单倍体细茎野生种AP85-441 (4=32)的全基因组测序，但更高倍性的原种和甘蔗杂交品种等染色体水平基因组序列尚难以完成。染色体分选技术可为甘蔗基因组研究提供一种有效手段，通过对甘蔗栽培种染色体逐条分选完成全基因组的测序,为甘蔗栽培种遗传和物理图谱的构建，遗传育种的分子标记开发提供基础。目前，有研究首次报道了利用流式细胞技术制备甘蔗完整染色体悬浮液的方法[39]；并且通过对甘蔗的2热带种和3个杂交种材料进行流式核型分析，发现甘蔗热带种的峰图比杂交种峰图更突出，且具有更多分离的峰。研究结果表明这种差异可能与杂交种具有双基因组结构有关。这种通过流式细胞术分选甘蔗染色体的方法将使我们能够分离和分析目标染色体并对其进行测序，从而进一步研究甘蔗基因组的结构和进化。我们相信染色体分选作为一种不断完善的技术在植物基因组学研究中将有更加广阔的应用前景。

4 展望

4.1 染色体分选技术的开发与利用

染色体分选技术在高等植物中主要是通过利用染色体之间的较大差异来分选染色体，即通过单色荧光直接标记染色体，根据荧光信号强度，对染色体形态差异明显的峰值图或聚集成簇的散点图进行分选[40]。这种方法只能分选1条或几条形态差异大的染色体，并不能按照研究人员的意图分选染色体，并且分选出来的染色体会含有少量非目标染色体，影响研究结果。

随着染色体分选技术的发展，通过开发特异的分子标记结合悬浮液荧光原位杂交技术可以实现按照人们意图选择想要分选的染色体[41]；这种双色荧光采用两种核酸染料分别对整条染色体和杂交探针位点进行标记，通过两种不同荧光信号强度可以分选出任意带有分子标记的染色体，且这种方法分选出来的染色体纯度更高。然而，有效分子标记探针的缺乏阻碍了其进一步发展，目前常用的标记探针只有45S和5S[28]，因此开发更多新的染色体特异的分子标记是提高染色体分选效率的关键。

染色体分选技术虽然可以一次性收集几万到几十万条单一类型的染色体，但所含的DNA含量还是太少了，还达不到三代测序所需的5~10g的数值含量，Capal等提供了一种可将分选出的染色体DNA经纯化后扩增的方案，该方案拓展了染色体基因组学的潜力，并为染色体结构杂合性和植物单倍型定相研究开辟了新的途径[42]，但该方案仍存在扩增后的组装序列片段小的问题。

4.2 染色体分选技术在基因组学研究中的作用

基因组测序技术的应用为评估植物基因组组成提供帮助，并有助于将基因组学方法引入到植物改良项目中。基因组测序技术在小基因组物种和有参考基因组序列的植物中应用较为简单。然而，对于一些没有参考序列，基因组庞大、复杂的物种, 整个基因组的测序数据很难处理和使用。例如，普通小麦包含3个基因组(AA、BB、DD)，基因组序列数据约为17 GB, 其中重复序列高达85%[43]。对于这样复杂基因组物种来说，全基因组测序是难以完成的。因此，运用流式细胞术分选单条染色体或染色体臂为降低基因组的复杂性提供了一种有吸引力的方法。自然界中有很多植物和小麦一样拥有复杂的基因组，对他们进行基因组学研究还存在困难，而染色体分选是通过分选出单条染色体逐条完成基因组测序，简化了测序和组装的过程。将染色体分选技术应用于同样复杂的甘蔗基因组研究中也是一种可行的方案，可为甘蔗基因组测序和组装提供新的技术支持。我们相信，随着染色体悬浮液制备方法的优化，流式细胞术多参数分析和分选技术的开发，染色体分选技术在高等植物中的应用越来越广，为高等植物的复杂基因组研究提供了另一种视野。

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Applications of Chromosome Sorted in Botany Research

QIAN Wang1, WANG Qiu-song1, YANG Shan1,2, XU Liang-nian1,3,4*, DENG Zu-hu1,2,4*

(1. National Engineering Research Center of Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002, China; 2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources,Nanning 530004, China; 3. Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology,Nanning 530004, China; 4. Key Lab of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Fuzhou 350002, China)

The basic principle of chromosome sorting technology and the basic process of sample treatment were introduced. The chromosome suspension was prepared by synchronizing the apical meristem. And then the target chromosomes with high purity and high quantity were obtained by flow cytometry. The main applications of chromosome sorting technology in plants were reviewed, including the construction of physical maps, the development of DNA molecular markers, and genome sequence of the complex polyploid plant. With the continuous improvement and development of chromosome sorting technology, the development of probe markers for chromosome sorting and the optimization of chromosome DNA purification and amplification technology after sorted, it will provide more effective help for the genomics research of polyploid plants such as sugarcane.

Chromosome sorted; Flow cytometry; Genome; Polyploid plant

10.11926/jtsb.4262

2020–06–08

2020–08–02

国家自然科学基金项目(31771863); 中国现代农业技术专项基金项目(CARS-170106); 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室项目(SKLCUSA-a201912, SKLCUSA-b201806); 福建农林大学科技创新专项基金(KFA17168A, KFA17525A, KFA17169A, 2018N1002)资助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771863), the Special Project for Modern Agriculture Technology of China (Grant No. CARS-170106), the Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources (Grant No. SKLCUSA-a201912, SKLCUSA-b201806), and the Special Project for Science and Technology Innovation of Fujian Agriculture and Forestry University (Grant No. KFA17168A, KFA17525A, KFA17169A, 2018N1002).

钱旺(1995~ )，男，在读硕士研究生，研究方向为作物遗传育种。E-mail: 719482561@qq.com

E-mail: dengzuhu@163.com; xuliangnian@163.com