β-受体激动剂的性质及其残留量测定时的关键点

周迎春 华向美 李单单

1.河南进口肉类指定口岸漯河查验区服务中心 河南漯河 462300 2.漯河海关 河南漯河 462300

在国家相关监管部门的重点监管下，“瘦肉精”违禁添加到动物养殖过程中的情况得到了有效控制，但是在经济利益的驱动下，仍有不法养殖者在动物养殖过程中非法使用β-受体激动剂[1]，特别是在监管难度较大的牛、羊养殖屠宰销售环节，β-受体激动剂的使用现象较严重[2]。2017年，“315晚会”中对违法使用“瘦肉精”进行了点名报道。我国农业部在《2017年农产品质量安全专项整治方案》中提出了“瘦肉精”专项整治行动[3]。2021年央视“315晚会”曝光青县“瘦肉精”羊肉问题，再次将β-受体激动剂推向了舆论高潮，引发人们对食品安全的恐慌。除了一些已知的β-激动剂如CLB、RAC、SAL的滥用，新合成的β-受体激动剂化合物，虽然具有不同的结构，但是仍表现出营养再分配活性，如齐帕特罗、西布特罗、马布特罗等。β-受体激动剂的测定，需要科学准确的检测技术作为保障。熟悉β-受体激动剂的性质及其检测时的关键点是建立相应检测方法的基础，也是实现有效监管的关键所在。

1 β-受体激动剂的性质

β-受体激动剂俗称“瘦肉精”，它的基本化学结构为苯乙醇胺，具有典型芳香基团、β-羟基和脂肪族氮的一类合成化合物，其功能与肾上腺素和去甲肾上腺素功能类似。β-受体激动剂包括β1-激动剂、β2-激动剂和β3-激动剂。根据苯环上取代基的差异，β-受体激动剂又可分为苯胺型、苯酚型、卤取代型3种类型。当苯环上的取代基中具有氨基时，为苯胺型，例如CLB；当苯环上的取代基具有羟基时，为苯酚型，例如SAL和RAC。由于酚羟基具有弱酸性，因此β-受体激动剂在负离子模式下也具有一定响应，但它们正离子模式下的响应更好。当苯环上的取代基仅有卤元素时，为卤取代型，例如马布特罗。

β-受体激动剂化学性质稳定，加热到172℃时才分解，因此，一般烧煮加热方法不能将其破坏。β-激动剂的物理和化学性质相似，大多数β-激动剂为白色结晶颗粒或粉末，无臭且苦[4]。SAL，分子式C13H21NO3，分子量239.3100，呈粉末状，白色、基本无味，在乙醇中可快速溶解，微溶于水，熔点为154～158℃[5]。CLB，分子式C12H18Cl2N2O，分子量277.1000，为白色结晶固体，无臭，溶于水、乙醇，微溶于丙酮[6]。CLB经人体吸收后，可导致血液中K+含量下降，从而使机体出现心律失常、急性中毒现象，抢救不及时甚至会引起死亡[7]。RAC，分子式C18H23NO3，分子量301.3801，多以盐酸盐的形式存在，在丙酮中稍溶，可溶于水、乙醇[8]。西马特罗(Cimaterol)，分子式C12H17N3O，分子量219.2800。齐帕特罗(Zilpaterol)，分子式C14H19N3O2，分子量261.3200。马布特罗(Mabuterol)，分子式C13H18ClF3N2O，分子量310.7500。

2 β-受体激动剂的作用及危害

β-受体激动剂在临床医学中一般用作于治疗哮喘药物，该类物质以超过治疗剂量5～10倍的用量用于家畜饲养时，具有显著的“营养再分配效应”，可促进动物体蛋白质沉积、脂肪分解并有效抑制脂肪沉积[9]，从而显著降低脂肪含量、促进肌肉纤维的生长[10]、提高瘦肉率[11]和饲料转化率[12]，但是β-激动剂是一种非法的饲料添加剂。

β-受体激动剂化学性质稳定，在动物组织中不易被分解，因此可通过食物链在人体内逐渐积累，对人体健康有害[13]：可导致急性中毒，引起肌肉振颤、心慌、战栗、头晕、头疼、恶心、呕吐、心跳加速甚至心脏骤停致昏迷死亡等症状[14，15]，会导致染色体畸变的可能，诱发恶性肿瘤，特别是对高血压、心脏病、青光眼、糖尿病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡[16]。

3 各国对β-受体激动剂的禁用情况

为了食品安全，1996年，欧盟96/22/EC令禁止将β-受体激动剂用于食用动物养殖中[17]；中国农业部1997年发文禁止将“瘦肉精”使用在饲料和畜牧生产中；自2009年12月9日起，我国商务部禁止进出口莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)与克伦特罗(Clenbuterol，CLB)；农业部第176号[18]、第193号[19]和235号[20]公告明确将CLB、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、RAC、西马特罗及其盐类、酯类列为可食品动物禁用的兽药化合物清单，并规定在动物性食品中不得检出该类药物；我国农业部公告第1519号禁止多种β-受体激动剂在动物饲料和饮用水中使用[21]；2011年国家食品安全委员会规定了16种禁用β-受体激动剂的品种[22]。我国《农业部办公厅关于印发茄果类蔬菜等58种无公害农产品检测目录的通知》(农办质[2015]4号)中规定牲畜的可食组织中的CLB、RAC和SAL是禁止检出的。

由于肝脏、肾脏中的β-受体激动剂残留量较大且中国、俄罗斯和欧盟对内脏的摄入量相对较多，因此他们均出台了一系列法律法规，禁止在饲料中添加SAL、CLB、RAC等β-受体激动剂[23]。美国、加拿大、日本等国家规定了残留标准，但并没有禁止使用“瘦肉精”[24，25]，包括美国在内的其他22个国家，将RAC批准用于猪、牛和火鸡的动物养殖，此外齐帕特罗被批准用于南非和墨西哥的动物养殖[26]。根据联合国粮农组织和世界食品添加剂联合专家委员会(JECFA)规定，RAC在肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中的最大残留限量(MRL)分别为10、40、90和10μg/kg[27]。世界卫生组织(WTO)和美国食品药品管理局(FDA)以及国际食品法典委员会(CAC)推荐CLB的MRL为：脂肪和肌肉中为0.2μg/kg。此外，欧洲立法提出了马和牛肝脏中CLB的MRL为0.5μg/kg[28]，同样，中国国家标准GB/T 5009.192-2003动物性食品中克伦特罗检测标准中检测限(LOD)也定为0.5μg/kg[29]。日本与国际食品法典委员会(CAC)推荐的猪、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL相同，均为10μg/kg，而澳大利亚对猪、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL规定分别为：200μg/kg、50μg/kg[30]。此外，中国和欧盟普遍禁止所有化合物用作生长促进剂，并发布了大量法规来监测和控制非法使用β-激动剂作为生长促进剂[31]。可见，制定科学准确的β-激动剂残留量检测方法也是应对国际贸易壁垒的有效措施。

4 β-受体激动剂残留量测定时的关键点

4.1 酶解提取

β-受体激动剂的芳香环结构上均有烷羟基或羟基，在动物体内的代谢过程中，它们大部分都与硫酸或葡萄糖醛酸发生作用，生成β-葡萄糖醛酸结合物和氧化产物[32]，这些代谢产物不易溶于有机试剂，但易溶于水[33]，因此样品的前处理一般采用先水解使目标化合物游离出来，再提取富集目标化合物。水解常采用酶水解和酸水解2种。酸水解以使用无机酸为主，但无机酸的作用强度往往较大，不易准确控制反应过程。β-葡萄糖醛苷酶进行水解处理过程中，一般不会破坏待测物β-受体激动剂的结构，重现性好，有利于提高方法的回收率[34]。

β-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶酶解有助于充分释放组织中的β-受体激动剂，提高检测的准确性。苯胺型β-受体激动剂的结构轭合反应率及蛋白结合率较低，如CLB。苯酚型β-受体激动剂的轭合代谢过程较强，苯环上羟基是结合的位点，形成葡萄糖醛苷代谢物，如SAL在组织和排泄物中主要以硫酸轭合物、葡萄糖醛酸轭化物形式存在。RAC在组织和排泄物中也主要以葡萄糖醛酸轭化物形式存在。在酸性环境下，苯胺型β-受体激动剂很容易由结合态转变为游离态，所以只测定CLB时，可以省去酶解步骤；SAL和RAC等苯酚型β-受体激动剂轭合代谢过程较强与蛋白结合率高，所以这类β-受体激动剂残留量测定时是需要酶解的。石静飞[35](2014)在前期研究基础上优化检测方法，利用β-葡萄糖醛酸酶酶解样品，酶解液经5%氨水乙酸乙酯超声提取，通过MCX固相萃取柱净化，从而建立了一种沙丁胺醇、齐帕特罗、莱克多巴胺、克仑特罗、苯乙醇胺A共计5种β-受体激动剂残留量的检测方法，测定对象主要有猪和山羊的肝脏、肌肉、脂肪、肺脏、大小肠、尿液、粪便和毛发等11种组织，该方法能够满足确证方法学要求。该研究表明，脂肪组织中SAL不酶解会显著影响测定结果。

目前动物源性食品中β-受体激动剂检测标准主要有GB/T 21313-2007、GB/T 22286-2008、SN/T 1924-2011及农业部1025号公告-18-2008，以上4个标准均采用37℃下避光酶解16h的方式把结合态的β-受体激动剂释放出来。有研究表明：40℃避光水浴酶解2h后，测得CLB、SAL、RAC的回收率、提取率、和精密度也均能满足实验要求，可见通过优化酶解温度、酶解时间，可以有效缩短实验室前处理时间，提高了检测效率[36]。

样品中的基质成分可以增强或抑制被分析物的响应，高效的样品制备可在一定程度上减弱基质效应。同位素内标使用简便，可有效提高回收率和检测准确度。常用的同位素内标包括氘代同位素内标和碳同位素内标，β-受体激动剂残留量检测时一般用氘代同位素内标。

4.2 净化和浓缩

适当的样品前处理可减少干扰和避免可能的基质效应[37]。β-激动剂在游离状态下可溶于大多数有机极性溶剂和弱酸性或弱碱性的无机溶剂中[38]。盐酸CLB为强极性物质，易溶于甲醇、乙醇和水，微溶于丙酮，不溶于乙醚。这些盐不具有非极性结构，因此不溶于疏水溶液，其在疏水溶液中的不溶性可用于提取纯物质[39]。正己烷作为疏水溶剂，去除脂肪方便、快捷，因此采用正己烷对β-受体激动剂提取液进行除脂。

众所周知，样品前处理是痕量残留特别是非法药品残留分析中的一个重要步骤。由于实际样品中目标分析物的微量浓度和食品基质的复杂性[40]，食用脂肪中β-激动剂药物的测定是一项具有挑战性的任务。液液萃取，固相萃取(SPE)、微萃取和分子印迹聚合物萃取或上述样品制备方法的集成程序，用于对复杂样品的清理，以减少样品基质干扰[41]，具有重现性好、回收高等优势[42]。MCX小柱可有效吸附混合型阳离子以及碱性物质，而MAX小柱对混合型阴离子以及酸性物质具有更高的吸附力[43]，因此，可选用MCX固相萃取小柱对样液进行净化。

洗脱阶段是利用MCX固相萃取小柱净化的关键步骤，一般情况下β-受体激动剂多使用氨化有机溶剂进行洗脱。由于CLB、SAL、RAC等β-受体激动剂的分子结构中都存在氨基和羟基，属于酸碱两性基团，因此在选择洗脱液时，常用氨化甲醇或用异丙醇等带羟基的试剂，如氨化甲醇、氨化乙酸乙酯等。

真空水浴抽干耗时较长，旋转蒸发较氮吹耗时短，但易损失、纯化程度不高[35]，因此采用氮吹进行浓缩更有利于β-受体激动剂残留量检测的准确性。

4.3 仪器条件

基于HPLC、GC-MS、LC-MS或LC-MS/MS、毛细管电泳电化学检测和免疫分析法(EIA)的多种分析方法均可用于检测β-激动剂。在这些方法中，LC-MS/MS方法被认为是目前检测食品中多种兽药最合适的技术，对定量测定的灵敏度和选择性最高，提供了明确的识别和可靠的确认，已发展成为主要的分析方法[44]。

动物体内β-激动剂及其产品检测的确证方法主要采用气相色谱质谱(GC-MS)和液相色谱质谱(LC-MS)或串联质谱(LC-MS/MS)。在确认目的的框架内，质谱法是欧洲立法考虑到的唯一分析技术。GC-MS可用于β-激动剂的定量和定性分析，但由于β-激动剂的极性强，衍生过程复杂，使用液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)已被公认为β-激动剂的检测技术。LC-MS/MS结合了LC的分析分离功能以及MS的鉴定及解析结构[45]，有着准确度高、专属性好、精密度高、灵敏度高等明显优势[46]。

迄今为止，已有大量基于LC-MS/MS的分析方法用于检测不同样品基质中的β-激动剂[27]。如现行标准SN/T 4817-2017中就是采用液相色谱-质谱/质谱法对进出口食用动物中CLB、SAL、RAC残留量的测定[47]。LC-MS/MS分析中常用的质谱离子源是电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)，APCI适合分析中等极性及弱极性的化合物，ESI用于大分子或极性的化合物，β-受体激动剂属于强极性化合物，因此本标准采用了ESI源作为离子源进行检测[48]。依据β-受体激动剂属于碱性物质，选用正离子模式进行分析测定。

5 小结

β-受体激动剂作为一类物质，具有相似的结构和性质，在实际检测中，将β-受体激动剂从样品组织中有效游离出来，实现β-受体激动剂的高效富集及净化，保证仪器检测的准确性是β-受体激动剂残留量测定时的关键步骤，决定着检测结果的精准性。