传统陇西腊肉制作过程中挥发性风味物质变化分析

毛永强，李彦虎，贠建民，何奎，王睿，武淑娟

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)

陇西腊肉是一种甘肃传统发酵肉制品，已有300多年的历史，是以漳县、岷县一带蕨麻猪的五花肉为原料，添加食盐、花椒、冰糖、小香、姜皮、桂皮、草果、豆蔻、桂籽、大香等十多种辅料，在冬腊月以传统方式腌制而成[1]。陇西腊肉滋味纯美，瘦肉红灿，肥膘晶莹，香味浓郁而不腻，深受西北民众的喜爱[2]。但工艺落后、技术理论尚不完善已成为制约陇西腊肉发展的因素[3]。在工艺现代化改进过程中，如何保持传统产品的良好风味至关重要。

发酵肉制品的风味物质主要包括挥发性和非挥发性两大类，且挥发性化合物对制品整体风味起关键性作用[4]。就目前研究进展来看，挥发性风味成分的形成途径有3种，分别是Maillard 反应[5]，营养物质代谢[6-8]和微生物发酵作用[9-11]。对发酵肉制品中挥发性风味物质的研究已有不少报道，如郭昕等[12]检测了3种不同类型腊肉的挥发性风味成分时发现，各腊肉间既含共有香气成分，又含特征香气成分；宋永等[13]检测哈尔滨风干肠时发现，其关键风味化合物是己酸乙酯、乙醇、己醛和丁酸乙酯；李鑫等[14]利用吹扫捕集/顶空固相微萃取-气质联用分析金华火腿挥发性风味物质，共检测出106种挥发性风味物质；赵改名等[15]研究发现金华火腿风味物质是在加工过程中逐步形成的，且不同阶段风味物质的含量及其比例各具特征。

不同类型的发酵肉主体风味成分不同，风味物质种类繁多，但并非所有的挥发性物质都对产品的风味有贡献，气味活性化合物的确定是食品风味研究的热点和重点。目前，关于陇西腊肉风味的研究已有报道，师希雄等[16]采用气相-质谱分析检测了陇西腊肉中的风味，共检测出42种挥发性物质，发现萜烯类、醛类、含硫含氮及杂环类物质等共同组成陇西腊肉的风味基础。但关于传统陇西腊肉在制造过程中气味活性物质演变规律及关键风味物质尚不明确，使得陇西腊肉在现代化工业生产中风味控制技术的研发缺乏理论指导。

为此，本试验利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技术对传统陇西腊肉制作过程中挥发性组分进行动态跟踪检测分析，以期明确陇西腊肉制作过程中挥发性物质的变化规律，并明晰关键风味物质，为今后陇西腊肉加工过程中风味形成及调控提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陇西腊肉：采自于甘肃省陇西县大胡子传统腊肉生产基地。

试剂：2-辛醇(色谱级)，美国 Sigma 公司；NaCl(分析纯)，购置于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7000D 安捷伦三重串联四级杆气质联用仪(配有 EI 离子源和NIST MS 数据处理系统)，美国 Agilent 公司；PAL3 自动三合一进样器系统，美国 Agilent 公司；SW-CJH-2FD超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集

腊肉样品采自于甘肃陇西大胡子腊肉生产基地，跟踪采集陇西腊肉一个批次生产完整过程。根据陇西腊肉制作过程关键时间节点，确定5个采样时间点(表1)，采样完成后样品置于冰盒内当天运回实验室进行分样，每份样品不少于2.5 kg。每个时间点需要采集3个平行样品，然后充分混合均匀，准确称取样品分装于若干个无菌取样管，并按照不同采样时期编号，以上过程均在超净工作台内完成，经液氮冷冻后存于-80 ℃冰箱，以备进行相关指标的测定，样品具体分组信息如表1所示。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.3.2 挥发性风味检测

(1)萃取条件：参照师希雄等[16]方法并做修改，具体过程为：准确称取10 g腊肉样品、2 g NaCl于20 mL配有硅胶密封垫圈的玻璃瓶内，在70 ℃水浴锅加热平衡10 min。然后将顶空萃取头插入玻璃瓶内，推出纤维头进行顶空萃取。萃取时间为30 min，萃取完成后，于245 ℃的GC-MS进样口解吸10 min。萃取不同样品需老化萃取头，老化时间3 min。

(2)GC条件：参照师希雄等[16]方法并做修改，使用毛细管色谱柱OV-1701(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，起始温度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率上升至180 ℃保持3 min，以4 ℃/min升温至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升温至245 ℃，保持15 min；载气(He)，流速1.0 mL/min。不分流进样。

(3)MS条件：参照师希雄等[16]方法并做修改，EI离子源：70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度为250 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描质量m/z为40～600。

按匹配度大于800，采用质谱NIST谱库检索比对定性分析。采用内标法进行半定量分析，内标为2-辛醇，质量浓度为88.01 μg/L。风味物质含量计算如公式(1)所示：

(1)

式中：X表示挥发性风味成分的质量浓度，μg/L；f代表内标物的校正因子，值为1；A表示挥发性风味成分的相对峰面积百分比；C表示添加内标物的质量浓度；A0为测得内标物的相对峰面积。

(4)关键挥发性物质评价

参照刘登勇等[17]方法并做修改。样品中关键挥发性风味物质采用相对气味活度值(relative odor activity value，ROAV)分析法确定。在此之前，需要先确定对样品风味贡献最大的挥发性组分。

鉴于此，本研究采用气味活度值(odor activity value, OAV)方法，即嗅感物质的绝对浓度(C)与其感觉阈值(T)之间的比值，计算如公式(2)所示：

(2)

根据(2)式定义，我们规定对样品风味贡献最大的挥发性组分ROAVmax=100，其他挥发性组分ROAV值计算如公式(3)所示：

(3)

式中：Ci和Cmax分别表示各挥发性组分的相对含量(%)和对样品总体风味贡献最大挥发性组分的相对含量(%)，Ti和Tmax表示各挥发组分的感觉阈值(μg/L)和对样品总体风味贡献最大组分的挥发性组分的感觉阈值(μg/L)，对样品总体风味的贡献越大，挥发性组分的ROAV值一般越大。

1.3.3 感官评价

参照孔晓雪等[18]方法，并做修改。选择10位无饮食偏好的人员且经过专业训练，组成感官评价小组，将各时期样品分开蒸熟，切成厚度为0.5 cm的切片，分别以肉色、口感、气味、滋味、组织状态5项指标对不同时期腊肉样品品质进行评定，以此确定制作过程中感官品质的变化。评分表见表2。

表2 感官评价标准表Table 2 Standards for sensory evaluation

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0对数据进行统计处理和绘制图表，利用Heatmap软件进行风味热图可视化，SPSS 19.0 进行显著性差异及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 各时期挥发性化合物种类及含量变化

传统陇西腊肉制作过程中挥发性化合物种类及含量变化如图1、表3所示，各挥发性物质中除酸类物质外，其余各类挥发性化合物随工序的进行均呈上升趋势。各时期共检测出81种挥发性化合物，其中烃类13种，主要是苯乙烯；醛类19种，主要是己醛；酯类11种，主要是辛酸乙酯；醇类14种，主要为1-辛烯-3-醇；有机酸11种，主要是癸酸、己酸；酮类8种，主要是苯乙酮、3-羟基-2-丁酮；其他5种。按时期分：原料期(T0)58种，总含量1 362.06 μg/kg；腌制中期(T15)69种，总含量2 584.38 μg/kg；腌制后期(T30)79种，总含量4 473.05 μg/kg；风干期(T60)77种，总含量2 255.84 μg/kg；成熟期(T90)76种，总含量2 926.59 μg/kg。腊肉中挥发性化合物含量的高低并不能代表其对风味贡献度的大小，要确定其对腊肉风味贡献的大小，还需进一步分析。

表3 各时期样品中挥发性物质GC-MS检测结果Table 3 GC-MS results of volatile compounds in samples of different periods

续表3

图1 各时期样品中挥发性物质种类变化Fig.1 Variation of volatile substances in samples of different periods

2.2 挥发性化合物聚类分析

为进一步确定各时期的香气成分特点，将挥发性化合物进行热图分析，结果见图2。不同制作时期的样品中挥发性物质的组成及含量存在较大的差异。根据热图中不同时期挥发性物质的聚类分析可知，样品T30与样品T60以及样品T90聚在一起，说明腌制后期与风干中期以及成品肉中挥发性物质的组成及含量相似。而且，T30、T60、T90样品中热图颜色以灰绿色、暗红色为主，并且，蓝紫色较少，说明挥发性物质主要形成于陇西腊肉制作的中后期。

图2 样品中挥发性物质含量热图Fig.2 Heat map of volatile substances in samples注：热图中蓝紫色表示风味物质含量为零，颜色由绿色向红色表示风味物质含量由低到高的变化

2.3 样品ROAV分析

发酵肉的挥发性化合物中，对香气起主要贡献作用的通常仅是一小部分化合物。为进一步挖掘陇西腊肉中对风味有重要贡献的主体挥发性化合物，基于OAV法和ROAV法并结合挥发性物质感觉阈值对其进行筛选，根据每组样品的平均值确定ROAV评分。

结果如表4所示，ROAV值为1～100的物质总共有22种，ROAV值在0.1～1共有8种。其中ROAV≥1的烃类物质主要是D-柠檬烯、苯乙烯、月桂烯；醛类物质主要是3-甲基丁醛、辛醛、(E)-2-壬烯醛、己醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、庚醛；脂类物质主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香叶酯、乙酸乙酯；醇类物质主要是1-辛烯-3-醇和芳樟醇；酮类物质主要是2,3-辛二酮，除此之外，还有2-戊基呋喃、茴香醚。初步证明这些化合物是腊肉制作过程中对风味起主要贡献的物质。另外，由于烷烃、有机酸类物质感觉阈值比较高，对风味贡献作用不明显。

表4 陇西腊肉中关键挥发性风味物质确定Table 4 Determination of key volatile flavor substances of Longxi bacon

2.4 样品主成分分析

主成分分析方法主要研究ROAV≥1的风味物质，并提取主成分特征值不小于1的主成分，所得结果如表5所示,前3个主成分的累积方差贡献率为86.49%。

表5 主成分特征值及方差贡献率Table 5 principal component eigenvalues and variance contribution rates

图3-A、图3-B为陇西腊肉制作过程中关键性风味物质的主成分载荷图。分别以第一主成分为横坐标，第二和第三主成分为纵坐标作图，此图说明了关键的挥发性风味物质对主成分的影响。由表5可知，其第一、第二和第三的方差贡献率分别是34.98%、31.12%和20.39%。其中，PC1中载荷正向最高的物质S19(己酸乙酯)，载荷负向最高的物质为S20(辛酸乙酯)；PC2中载荷正向最高的物质为S16(己醛)，负向最高的物质为S13(3-甲基丁醛)；PC3载荷正向最高的物质为S28(芳樟醇)，载荷负向最高的物质为S12[(E)-2-辛烯醛]。上述结果说明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是不同时期样品中风味物质含量有明显差异的挥发性物质，能很好的区分各时期的样品。

图3 陇西腊肉关键挥发性风味物质主成分载荷图Fig.3 Load diagram of principal components of key volatile flavor substances of Longxi bacon注：图中字母分别与表4相对应

同时，不同时期的样品分别位于4个象限，并且主成分1、2、3能很好地区分不同时期的样品，但风干后期(T60)与成品期(T90)始终位于同一象限，与热图(图2)聚类结果相似，说明这2个时期内关键风味物质相似，并且主体风味物质主要在这两个时期内形成。

2.5 感官评价结果分析

腊肉感官品质直接决定了消费者的饮食偏好。因此，开展感官评价对于把握其品质变化显得尤为重要。由表6、图4可知，陇西腊肉总体感官评分随着制作过程进行逐渐增加，其中成品肉评分最高为 95.3分，说明随着制作过程的变化和时间延长，腊肉品质日益良好，尤其表现在肉色、口感、气味、组织状态方面，但滋味评分在腌制期内(T15、T30)有所降低，这是由于腌制期内氯化钠分布不均匀，导致肉胚内、外层咸味不均一所致。

表6 感官评分结果 单位：分Table 6 Sensory score results

图4 感官评价雷达图Fig.4 Sensory evaluation radar map

3 讨论

传统陇西腊肉制作过程中的挥发性化合物的变化情况不同。检测出的醛类物质在种类(19种)和含量(4 162.13 μg/kg)上都是最丰富的，主要是己醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛和(E)-2-庚烯醛等，这些物质的含量在腊肉制作过程中变化趋势不同，其中己醛在腌制中期(T30)时含量最高，壬醛则在成熟期(T90)时含量最高。研究发现，醛类物质主要是脂肪氧化产生[20]，己醛主要是亚油酸和花生四烯酸的产物[21]，而壬醛则是油酸氧化产生[22]，己醛和壬醛分别具有青香味和脂肪味，对腊肉风味有重要贡献。3-甲基丁醛风味阈值很低，只有0.2 μg/kg，且具有坚果香味[23]，对腊肉整体风味有重要贡献作用。

醇类物质也是陇西腊肉中含量(2 736.47 μg/kg)较高的化合物，在整个过程中，其含量呈上升趋势。ROAV分析结果来看，主要风味贡献物质是1-辛烯-3-醇和芳樟醇。其中，1-辛烯-3-醇阈值较低，是脂肪酸氧化的产物，可赋予腊肉蘑菇味、柑橘和玫瑰气味，还可增强肉中的脂肪香味[24]，也有研究发现1-辛烯-3-醇是火腿中的重要风味物质[23]。芳樟醇在原料肉(T0)中未发现，在腌制期开始检出，可能是由于香辛料添加的结果。芳樟醇呈现花香和薄荷香气，可为腊肉提供良好的风味[25]。但是，醇类风味阈值相对较高，可能对腊肉风味的整体贡献率较低[24]。

检出的酮类和酯类物质含量相对较低，在整个过程中，酮类物质呈先增后降的趋势，酯类物质一直呈上升趋势。本研究结果显示，陇西腊肉中酯类物质主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香叶酯和乙酸乙酯，而这些物质主要呈现菠萝味等水果味[26]，是陇西腊肉中重要的风味来源，这些酯类物质与广式腊肉中酯类物质构成相似[12]；酮类物质主要是2,3-辛二酮, 其风味阈值也较低，为3 μg/kg，具有奶油香味，对腊肉香气形成有重要作用，白卫东等[27]在广式腊肉中也检出了此类物质。其他类物质中2-戊基呋喃含量较高，其阈值也相对较低，呈植物芳香味[28]，研究发现2-戊基呋喃是腊肉中都含有的重要风味化合物[29]。

随着工序变化，陇西腊肉感官品质(肉色、口感、气味、组织状态、滋味)日益良好，感官评分结果与挥发性风味物质的组成和变化的变化趋势基本一致，这表明挥发性风味物质成分和含量的变化直接影响了腊肉的感官特性，是评价腊肉品质的重要指标。传统陇西腊肉属自然发酵肉制品，微生物作用也是其制作过程中风味形成的重要因素，这也是后期研究的方向。总之，构成腊肉风味的物质基础丰富多样，而且风味形成反应机制复杂，要完全明晰风味形成机理还需进行大量研究。

4 结论

本研究采用SPME-GC-MS技术对传统陇西腊肉制作过程中的挥发性风味物质的变化进行动态检测分析，共鉴定出烃类、醛类、酯类、醇类、有机酸、酮类等挥发性成分共81种。在腊肉制作的不同时期(T0、T15、T30、T60、T90)，各种挥发性物质的含量表现出一定的变化规律：挥发性物质总量呈先增高后降低的趋势，在腌制后期(T30)时达到最高，为4 473.05 μg/kg；样品中醛类物质含量最高，其次是醇类物质。ROAV分析结果显示醛类、酮类、酯类物质对风味贡献最大；主成分分析结果表明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是各时期样品中挥发性风味物质含量差异明显的化合物，能很好的区分各时期的样品。感官评分结果表明，样品在各评价指标上的评分随着加工时期的延长而增高，在成品期 (T90) 时最高，表明传统陇西腊肉在整个制作过程中风味逐渐变好。