水溶性蚕蛹蛋白功能特性探究

李丹丹，谢盛莉，马良, ，侯勇，付余，张宇昊, *

1(西南大学 食品科学学院，重庆， 400715)2(西南大学 前沿交叉学科研究院，生物学研究中心，重庆， 400715)

蚕蛹(silkworm pupa，SP)是蚕蛾科家蚕蛾的蛹，属于蚕茧抽丝后的副产物。蚕蛹蛋白是蚕蛹干基中的主要营养物质，据研究，1 kg鲜蛹中蛋白含量相当于0.85 kg瘦猪肉、0.96 kg鸡蛋、1.09 kg鲫鱼中蛋白含量[1]，可作为一种优质昆虫蛋白源。蚕蛹蛋白含有18种氨基酸，8种必需氨基酸含量约40%，符合联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)联合食品标准建议的理想氨基酸模式[2]。吕汶骏等[3]采用FMOC-OPA柱前衍生化高效液相色谱法测定蚕蛹蛋白水解液中的氨基酸，8种必需氨基酸含量达49.09%，高于FAO/WHO建议的40%；秦伟佳等[4]通过比较提取前后蚕蛹蛋白的氨基酸组成发现，蚕蛹蛋白氨基酸种类丰富，配比合理，符合保健类食品药品要求，有着巨大的发展应用前景。

近年来，国内外研究主要集中在蚕蛹水溶性蛋白的提取、营养性等方面[5-7]，刘娟[5]采用连续分级提取法从文冠果蛋白中得到清蛋白(水溶性)、球蛋白(盐溶性)、醇溶蛋白和谷蛋白(碱溶性)。练钊[7]采用Osborn法从缫丝后蚕蛹中提取得到水溶性蛋白，并对其功能性质进行研究，结果表明蚕蛹中水溶性蛋白的氮溶性指数(nitrigen soluble index，NSI)为97.19%，具有良好的溶解性。谢盛莉等[8]研究表明，蚕蛹水溶性蛋白含量较高，过敏原含量极低，有直接开发蛋白产品或者用于食品添加的可能性。但关于蚕蛹水溶性蛋白的功能性质的研究，国内外鲜有报道。本实验以鲜蚕蛹为原料，对蚕蛹水溶性蛋白的功能性质进行研究，为蚕蛹水溶性蛋白相关食品的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜蚕蛹，家蚕实验品种“夏芳”，25 ℃，桑叶饲养,化蛹后第3天放置于-20 ℃冻存备用。

大豆油(九三牌)，购于重庆市永辉超市，使用时不进行纯化；盐酸，重庆川东化工(集团)有限公司；NaCl，上海易恩化学技术有限公司；十二烷基硫酸钠，美国Bio Basic公司；8-苯胺-1-萘磺酸，Sigma-Aldrich公司；30 g/100mL丙烯酰胺工作液(丙烯酰胺29 g，甲叉双丙烯酰胺1 g)、样品缓冲液(2X)，北京索莱宝科技有限公司；1.5、1.0 mol/L Tris-HCl，赛国生物科技有限责任公司；过硫酸铵，广东光华科技股份有限公司；蛋白Marker(10 kDa～200 kDa)，Thermo Fisher公司；考马斯亮蓝R-250，百奥生物技术有限公司；甲醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸，成都市科隆化学品有限公司。所有试剂均为分析纯，所有水均为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

DGG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；JA3003B电子天平，上海精天电子仪器有限公司；DW-3型数显电动搅拌器，昆山市超声仪器有限公司；HH-4数显恒温搅拌水浴锅，上海新诺仪器设备有限公司；Multifuge X3R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；F-380荧光分光光度计，港东科技；L8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；DSC 4000差示扫描量热仪，美国Perkin Elmer公司；MOS-500圆二色谱仪，法国Bio-Logic公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蚕蛹水溶性蛋白提取

鲜蚕蛹解冻，60 ℃干燥，粉碎，脱脂，纯水为溶剂，提取分离，提取液调节pH至等电点，沉淀透析48 h 后冷冻干燥，得到蚕蛹水溶性蛋白。

1.3.2 蚕蛹蛋白性质测定

(1)氨基酸分析

参照GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的测定》[9]。

(2)溶解性测定

参照简华君等[10]方法并做适当改动，用蒸馏水配制蛋白质量浓度分别为20、100、100 g/L的蛋白溶液，考察不同温度(20～100 ℃)、pH(4.0～12.0)、NaCl浓度(0.2～1.2 mol/L)对溶解性的影响，搅拌溶解30 min，5 000 r/min 离心15 min，采用双缩脲法测定上清液蛋白浓度。

(3)表面疏水性测定

采用8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)作荧光探针的方法测定[11]。用浓度分别是0.2～1.2 mol/L的NaCl配制0.1 mg/mL的蛋白溶液，并配制10 mmol/L的ANS溶液。取蛋白溶液2 mL，加入10 μL的10 mmol/L ANS溶液混合均匀，使用荧光分光光度计测定混合液的荧光强度(F1)，同时测定未添加ANS溶液的蛋白样品荧光强度(F0)，设定参数情况为激发波长380 nm、发射波长490 nm。

(4)乳化性测定

参照PEARCE等[12]的方法，配制1 g/L的蛋白溶液，添加不同体积分数的大豆油，使油相体积分数分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，10 000 r/min 均质1 min后立即从底部取50 μL乳化液，用1 g/L 十二烷基硫酸钠溶液稀释100倍后混匀，在500 nm 处测定吸光度，选择乳化性能较好时的油相分数作为固定油相体积分数。

固定乳化性能较好时的油相体积分数，配制不同质量浓度的蛋白溶液(1.0～9.0 g/L)与大豆油混合，根据以上方法，同样选择乳化性能较好时的蛋白浓度作为固定蛋白浓度。

同时选择乳化性能较好时的油相体积分数和蛋白浓度配制蛋白溶液，用0.1 mol/L HCI或NaOH溶液调整pH值为4.0～10.0，与大豆油混合后测定乳化性能，乳化活性和乳化稳定性计算如公式(1)、公式(2)所示。

(1)

(2)

式中：DF，稀释倍数；L，比色池光径，cm；C，蛋白质量浓度，g/mL；φ，油的体积分数；A0，0 min时测得稀释后的乳化液吸光值；A10，10 min时测得稀释后的乳化液吸光值。

(5)起泡性测定

参照王青松等[13]的方法，配制不同质量浓度的蛋白溶液(1.0～9.0 g/L)，分别取50 mL于100 mL的离心管中，高速涡旋振摇2 min后记录体积为V0，放置15 min后的体积记为V1，起泡性及泡沫稳定性计算如公式(3)、公式(4)所示。

(3)

(4)

式中：V0、V1，泡沫体积，mL。

(6)持油性测定

参照王青松等[13]的方法，称取0.5 g水溶性蛋白(m0)样品，置于50 mL离心管中，称重记录为m1,分别将5～25 mL大豆油加入到离心管中，50 ℃振摇2 h，8 000 r/min离心10 min，除去上层油液后称重记录为m2，持油性计算如公式(5)所示。

(5)

式中：m0、m1、m2，质量，g。

(7)聚丙酰胺凝胶电泳分析

参照杨晖等[14]的方法，制备12%(体积分数)的分离胶，5%的浓缩胶，将不同热处理后的蛋白溶液样品与样品缓冲液(2X)按2∶1比例混合，在沸水浴中加热5 min，分别取10 μL蛋白Marker(10 kDa～200 kDa)和10 μL样品注入上样孔中，电泳初始时设置电流为15 mA，待溴酚蓝跑到分离胶中部后，电流调至25 mA，当溴酚蓝跑到底部绿色胶条下底端时，停止电泳，关闭电源，在培养皿中加入适量的考马斯亮蓝R-250染色1 h 后脱色，每30 min换一次脱色液，直至条带清晰后用凝胶成像系统拍摄电泳图谱后进行分析。

(8)差示扫描量热法分析

取10 mg的蚕蛹水溶性蛋白固体样品，置于专用铝盒中压片，以空铝盒作对照，使用差示扫描量热仪进行扫描，氮气流速为20 mL/min，温度扫描范围为25～150 ℃，升温速率为5 ℃/min。

(9)圆二色谱扫描

参照陈雪珂[15]的方法，测定条件：蛋白样品质量浓度为1 mg/L，样品槽光径为0.1 cm, 在190～250 nm扫描，扫描速率1 nm/s，响应时间1 s，用缓冲液作为空白，累积次数3次。图谱分析采用CDPRO软件进行二级结构含量计算。

1.4 数据处理

每组数据均重复3次，用SPSS 19.0软件对试验数据进行显著性和相关性分析，使用单因素方差分析(ANOVA)方法分析数据，P<0.05表示差异显著，使用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 氨基酸分析

如表1所示，天冬氨酸与谷氨酸是蚕蛹水溶性蛋白氨基酸的主要成分，分别占7.09%、9.57%。蚕蛹水溶性蛋白氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量占总氨基酸的含量的39%，苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸与赖氨酸含量能满足成人需求，其中赖氨酸含量为6.34 g/100g，蛋氨酸含量为2.42 g/100g，这2种氨基酸分别是谷物蛋白和大豆等油料作物蛋白的限制性氨基酸。因此，在日常膳食及产品开发时，可考虑将水溶性蚕蛹蛋白作为蛋白来源或与植物性蛋白复配的成分，补充赖氨酸和蛋氨酸的摄入。在非必需氨基酸中，谷氨酸(9.57 g/100g)含量最高，其次是天冬氨酸为7.09 g/100g、组氨酸为 5.90 g/100g、脯氨酸为6.61 g/100g。水溶性蚕蛹蛋白是一种营养价值较高的蛋白，这将有利于其在食品行业中应用。

表1 水溶性蛋白氨基酸组成Table 1 Amino acid analysis of water-soluble proteins

2.2 溶解性测定

2.2.1 温度处理对溶解性及蛋白结构的影响

热处理是食品加工过程中常见的加工方式，大部分蛋白在高温热处理会发生不可逆的热变性，从而导致溶解度下降。如图1-a所示，蛋白溶解度随温度升高呈先上升后下降趋势，在50 ℃时，溶解度达到最大，之后开始缓慢下降，且温度大于80 ℃之后显著下降，结合图1-b，在20～50 ℃，电泳条带相差不大，60 ℃后水溶性蛋白的两个主要电泳条带逐渐变浅，100 ℃时蛋白条带已经很浅，表明蛋白亚基被严重破坏，发生变性聚沉。采用差示扫描量热法对水溶性蚕蛹蛋白进行分析，在热分析图谱上出现吸热峰表示该点已处在蛋白质热变性温度区域，并且这个峰值对应的温度即为该样品的热变性温度[16-17]。如图1-d所示，蚕蛹水溶性蛋白主要发生了3次热变性，蚕蛹水溶性蛋白第1次热变性的起始变性温度为70 ℃左右，峰值变性温度为76.8 ℃，结束变性温度为80 ℃左右，直观图观察显示此时玻璃瓶中蛋白溶液出现明显沉淀；第2次热变性的起始变性温度为100 ℃，峰值变性温度为104.2 ℃，结束变性温度为110 ℃，这个峰的出现可能与蛋白中含有的结合水有关；第3次热变性的起始变性温度为115 ℃，峰值变性温度为122.3 ℃，结束变性温度为140 ℃，这个峰相比于前两个峰宽更明显，可能与100 ℃电泳条带中的剩余的少量亚基有关。蚕蛹水溶性蛋白可以耐受70 ℃，30 min的热杀菌。因此在蛋白加工过程中，可对含有蚕蛹水溶性蛋白液体制品采用巴氏杀菌，提高产品的微生物安全性。

a-不同温度溶解性变化;b-蛋白亚基的变化;c-溶液外观变化;d-差示扫描量热法扫描图图1 温度对水溶性蚕蛹蛋白溶解度的影响Fig.1 Effect of temperature on solubility注：不同字母间表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.2.2 pH对溶解性及蛋白结构的影响

蛋白的溶解性与蛋白质的生理功能有关。如图2所示，在pH 4.0～12.0，随着pH的增加，溶解度呈显著上升趋势(P<0.05)。谢盛莉等[8]研究结果显示蚕蛹水溶性蛋白的等电点为3.8，pH大于等电点，pH越高，蛋白质带有的负电越多，其静电排斥力和离子水化作用增加，导致蛋白质分子之间不易发生聚集，从而增加了蛋白质的溶解度[18]。因此，蚕蛹水溶性蛋白更适合在中性或弱碱性的条件下使用。

图2 不同pH下溶解度的变化Fig.2 Solubility at different pH

蛋白质的二级结构可以通过圆二色谱(circular dichroism，CD)数据反映，一般蛋白质的CD光谱含有1个正峰(190 nm)和1个负槽(205～235 nm)，其中，主链构象与负槽的形状密切相关。α-螺旋结构在靠近192 nm有1个正的谱带，在222 nm和208 nm处有2个负的峰谱带；β折叠在216 nm附近有1个负谱带，在185～200 nm有1个正谱带，β转角在206 nm附近有1个正谱带[19]。如图3-a所示，水溶性蛋白的CD谱图在220 nm附近有强负吸收峰，是α螺旋的特征峰[20]。由图3-b可知，在pH 4.0～9.0，随着pH的增大，α-螺旋与β-折叠含量也逐渐增大，β-转角和无规则状态含量随着pH的增大而减少，表明水溶性蛋白二级结构之间的有序结构增多。这一变化现象与蛋白的溶解度随着pH的变化相一致，pH的增大促进了蛋白质溶解度的增加[20]，蛋白质之间的空间距离也相应增大，暴露出较多的α螺旋结构。pH 9.0后，α-螺旋与β-折叠总含量出现下降趋势，可能是在较强的碱性作用下维持这些结构的氢键及疏水作用力等部分被破坏，蛋白质有序度降低造成的。β-转角和无规则卷曲含量增多，蛋白展开程度较小且蛋白间的斥力增加，蛋白溶解度保持上升趋势。

a-水溶性蛋白在不同pH下的圆二色谱图；b-不同pH下蛋白二级结构的相对含量图3 不同pH下的圆二色谱图Fig.3 Circular dichromatograms at different pH

2.2.3 NaCl浓度对溶解性及蛋白疏水性的影响

由图4-a可知，随着NaCl浓度的增大，在0.2～1.0 mol/L内溶解度呈显著上升趋势(P<0.05)，造成这一现象原因是随着盐浓度的增加，盐类解离出来的离子与蛋白的解离基团离子相互作用增强，表面游离疏水基团减少，亲水性基团暴露增多，导致蛋白溶解度增大；但NaCl浓度过大(超过1.0 mol/L)，溶解度显著下降，盐离子解离出的离子与水分子结合，降低了蛋白与水分子之间的作用力，亲水基团暴露较少，亲水性减弱，导致溶解度下降[5]。

a-溶解性；b-疏水性图4 不同盐浓度下溶解度与表面疏水性变化Fig.4 Changes in solubility and surface hydrophobicity at different salt concentrations

蛋白质的表面疏水性与蛋白分子的内部结构、外界环境有很大关系[21]。在0.2～1.0 mol/L盐浓度内，随着NaCl浓度的增加，蚕蛹水溶性蛋白疏水值呈显著下降趋势，这一现象的原因是盐离子与蛋白的解离基团离子相互作用增强，导致表面游离疏水基团减少，疏水性下降。NaCl浓度大于1.0 mol/L时，疏水值呈显著上升趋势，盐离子解离出的离子不仅与蛋白的解离基团离子结合，还可以与水分子结合，使蛋白分子间的相互作用增大，亲水性减弱，疏水性增强[5]。因此，在进行盐溶性蛋白的溶解时，盐浓度应不超过1.0 mol/L，防止盐析现象的出现。

2.3 乳化性测定

2.3.1 油相体积分数对乳化性影响

乳化活性和乳化稳定性是评价蛋白质乳化性能的常用指标，与蛋白质分子的两亲结构、溶解度等因素有关[5,21]。如图5所示，在油相体积分数为20%～35%，乳化活性随油相体积增加呈显著上升趋势，可能是随着油相体积分数的增加，形成的界面面积增大，蛋白分子暴露的基团更易吸附在油水界面，界面上蛋白吸附量增多造成的[21]；油相体积分数为35%达到最大，表明蛋白乳化的油量最多；油相体积分数大于35%后乳化活性降低，可能是油相比例过大，体系中油滴之间的聚集增强[5]，破坏了油水界面的相互作用，界面蛋白吸附数量减少，乳化活性降低。乳化稳定性在油相体积分数20%时达到最大，之后乳化稳定性随油相体积分数的增加有不同程度的下降，油相体积分数的增加使油滴之间的聚集增强，破坏了油水界面的相互作用，界面上蛋白的吸附强度降低，稳定的乳化状态会受到破坏。考虑到较好的乳化活性与稳定性，可选择35%作为固定油相体积分数。

图5 油相体积分数对乳化性能的影响Fig.5 Effect of oil phase volume fraction on emulsification performance注：图中小写字母代表油相体积分数对乳化活性的差异显著、大写字母代表油相体积分数对乳化稳定性的差异显著(P<0.05)

2.3.2 蛋白浓度对乳化性的影响

蛋白浓度对乳化性有直接影响，如图6所示，在油相体积分数一定的情况下，蛋白质量浓度由1.0 g/L上升到9.0 g/L时，乳化活性呈下降趋势(P<0.05)，蛋白质量浓度超过5.0 g/L时，乳化活性增幅不明显。蛋白溶解度的增大引起蛋白浓度升高，溶解度与蛋白质表面电荷数有关[22]，油相分数一定时，不同浓度下蛋白质所带的电荷差异会对油水界面的稳定产生影响，引起界面蛋白吸附量和结合强度发生变化，界面蛋白吸附量和结合强度的下降导致乳化活性降低。乳化稳定性在蛋白质量浓度为1.0 g/L时最好，乳化稳定性下降是由于界面蛋白吸附强度降低引起，这与蛋白质本身的黏度、内部结构及表面电荷分布情况有关。综合考虑有较好的乳化活性和乳化稳定性，可选择1.0 g/L作为固定的蛋白浓度。

图6 蛋白浓度对乳化性能的影响Fig.6 Effect of protein concentration on emulsification performance注：图中小写字母代表蛋白浓度对乳化活性的差异显著、大写字母代表蛋白浓度对乳化稳定性的差异显著(P<0.05)

2.3.3 pH对乳化性影响

乳化活性与溶解度密切有关[22]。图7所示，在pH 4.0～10.0，乳化活性随着pH的增大呈显著上升趋势，乳化活性在pH 10.0时最大(P<0.05)，蚕蛹水溶性蛋白溶解度随着pH的增加而增加，亲水性基团暴露增多，疏水作用降低，蛋白质分子向油-水界面扩张能力增强，界面面积增大，乳化活性增加[23]。乳化稳定性整体呈先上升后下降趋势，蛋白等电点在pH 4.0左右，溶解度较低，乳化稳定性差[23]；在pH值为5.0时，乳化稳定性达到最大值，蛋白结构相对展开，疏水基团暴露更多，乳化稳定性增强；随着pH继续增加，蛋白结构逐渐有序化，疏水集团包埋使界面蛋白吸附能力下降，乳化稳定性下降；在pH 10.0时蛋白结构重新展开，疏水基团暴露，乳化稳定性增加。因此，蚕蛹水溶性蛋白作为食品乳化剂时需要在弱碱性条件下进行。

图7 pH对乳化性能的影响Fig.7 Effect of pH on emulsification注：图中小写字母代表pH对乳化活性的差异显著、大写字母代表pH对乳化稳定性的差异显著(P<0.05)

2.4 起泡性的测定

起泡性与乳化性都是蛋白的表面性质，都与蛋白的两亲结构、溶解性相关。如图8所示，随着蛋白浓度的增加, 蛋白质起泡性呈先上升后下降趋势，蛋白质量浓度在3.0 g/L时起泡性最高(P<0.05)。在1.0～3.0 g/L的蛋白质量浓度内，蛋白浓度适量增大促进水-空气界面的生成，增强起泡能力；起泡性在蛋白质量浓度大于3.0 g/L时下降，原因是随着蛋白浓度的继续增大，亲水基团数量增加的更多，泡沫形成能力下降。起泡稳定性随着蛋白的浓度增大呈下降趋势，稳定性在蛋白浓度为1.0 g/L时最高(P<0.05)，这是由于随着蛋白浓度的增加，蛋白分子之间通过非共价键重新形成更大的分子聚集体，水-空气界面膜的稳定性下降，膜黏性和厚度变小,泡沫稳定性下降[24]。

图8 蛋白浓度对起泡性的影响Fig.8 Effect of protein concentration on blistering property注：图中小写字母表示蛋白浓度对起泡性的差异显著、大写字母代表蛋白浓度对起泡稳定性的差异显著(P<0.05)

2.5 持油性测定

持油性是指蛋白质与油脂相结合的能力，与蛋白质种类、来源、加工方法、温度及油脂种类等有关[24-25]。如图9所示，随着油体积的增加, 蛋白质持油性呈升高后下降的趋势，在5.0～15.0 mL内，持油性显著上升(P<0.05)，持油性在油体积15.0 mL时最大(3.9 g/g)，之后持油性显著下降(P<0.05)。蛋白质的持油性与其构象及亲水亲油集团的平衡密切关联，持油能力主要与疏水基团暴露程度有关[26]，油脂含量过高时，蛋白表面单位疏水基团会结合更多的油脂，蛋白分子与油脂之间整体结合力减弱，持油性下降。与大豆蛋白(1.53 g/g)，腰果蛋白(2.84 g/g)的持油性相比[24]，蚕蛹水溶性蛋白持油性较好。因此可以考虑将其作为持油剂应用于食品工业中。

图9 大豆油体积对持油性的影响Fig.9 Effect of soybean oil volume on oil retention

3 结论

蚕蛹水溶性蛋白必需氨基酸种类丰富，天冬氨酸和谷氨酸是蚕蛹水溶性蛋白氨基酸的主要成分，苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的含量可满足成人需求，蚕蛹水溶性蛋白是一种营养价值较高的蛋白资源。

蚕蛹水溶性蛋白溶液在70 ℃条件下溶解度降低程度较小，可耐热巴氏杀菌；在pH 4.0～9.0内，随着pH的增大，α-螺旋与β-折叠含量也逐渐增大，溶解度因α-螺旋与β-折叠增加呈上升趋势；在pH 9.0之后，α-螺旋与β-折叠总含量出现下降趋势，较强的碱性，作用下维持这些结构的氢键及疏水作用力等部分被破坏，蛋白质有序度降低，β-转角和无规则卷曲含量增多，但因蛋白展开程度不大且蛋白间的斥力增加，溶解度仍随着pH的增加而增大。在0.2～1.0 mol/L的盐浓度内，溶解度随着盐浓度增大呈上升趋势，超过1.0 mol/L后因盐析作用溶解度下降。

油相体积分数35%，蛋白质量浓度1.0 g/L，pH 10.0时蛋白乳化性能较好；蛋白质起泡性在蛋白浓度3.0 g/L时最高，泡沫稳定性在蛋白质量浓度1.0 g/L 时最高；蛋白质持油性最大达到3.9 g/g。本实验结果为蚕蛹水溶性蛋白在食品工业中的进一步应用提供理论参考。