石榴皮提取物与焦磷酸钠复配对猪肉饼品质的影响

李保玲，李颖，刘苗苗，金文刚，马文慧，曹云刚*

1(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安, 710021)2(陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中，723001)

肉制品是人类摄入脂肪、蛋白质等营养物质的重要来源，其色泽、风味、嫩度、多汁性是影响消费者选购的重要指标。肉制品在加工和贮藏过程中脂肪和蛋白质容易发生氧化，导致肉制品的品质下降。大量研究证实肉制品中脂肪初级氧化成氢过氧化物，进一步氧化形成醛、酮、酸和烃类等小分子次级氧化产物，产生不愉快气味，影响肉制品的风味[1-2]。蛋白质氧化通常引起肌原纤维蛋白交联，导致原料肉持水性能下降、液汁流失严重[3-5]、硬度增大、嫩度下降[6-7]，并且蛋白氧化通常导致肉蛋白的乳化性、凝胶性及保水性等加工性能降低，最终影响肉制品的品质[8-10]。目前，实际生产中主要通过在肉制品中添加人工合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone，TBHQ)等，以抑制其脂肪和蛋白氧化，保持肉制品的风味和品质，延长货架期[11-12]。然而毒理学的研究发现，许多人工合成抗氧化剂具有一定的毒副作用或潜在致癌及致畸性，长期摄入对人体健康确实存在一定的潜在风险[13]。因此，天然植物源抗氧化剂在肉制品中的应用受到广泛关注。

石榴皮提取物含有大量的多酚类物质，如绿原酸、没食子酸、儿茶素等[14]，具有良好的抗氧化能力(自由基清除能力)。多聚磷酸盐是一种广泛应用于食品中的品质改良剂，经常应用于肉制品加工中以提高保水性[15-16]，且多聚磷酸盐具有螯合肉制品中激活氧化反应金属离子的作用，具有一定的抗氧化能力[17]，但并不能具备自由基清除能力[18]。异抗坏血酸钠通常应用于肉制品加工中以抑制脂肪氧化并协助肉制品发色。因此，本研究将石榴皮提取物(pomegranate peel extract,PPE)、异抗坏血酸钠(sodiumD-isoascorbate,D-VCNa)与焦磷酸钠(sodium pyrophosphate,TSPP)复配使用添加至猪肉饼中，通过测定猪肉饼在冷藏过程中的pH、蒸煮损失率、色差、质构等分析其品质变化，并通过研究猪肉饼的硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substance，TBARs)、总巯基和蛋白羰基的含量分析脂肪和蛋白氧化程度，明确天然抗氧化剂和多聚磷酸盐复配对冷藏过程中猪肉饼品质的综合影响，为肉制品的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪后腿肉(约克夏猪，俗称大白猪，6个月出栏，宰杀后排酸48 h)，购于陕西省西安市润家超市，置于冰盒运回实验室；石榴皮提取物[实验测得总酚含量为(93.70±9.34) mg/g，总黄酮含量为(181.96±3.44) mg/g，产品编号为CFSLY-A-708942]，陕西嘉禾生物科技有限公司提供;焦磷酸钠异抗坏血酸钠，天津市科密欧化学试剂有限公司；三氯乙酸、石油醚、2,4-二硝基苯肼、盐酸胍、5,5′- 二硫双(2- 硝基苯甲酸)等，上海瑞永生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯及以上纯度。

1.2 仪器与设备

PHS-25数显pH计，上海仪电科学仪器股份；MC-JHN30F电饼铛，美的集团股份有限公司；CM-5分光测色计，柯尼卡美能达(中国)投资有限公司；GENIUS 4K台式离心机，长沙市鑫奥仪器仪表有限公司；UV2900紫外-可见分光光度计，海舜宇恒平科学仪器有限公司；HR/T20M立式冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；TA.Plus物性测试仪，英国Stable Micro System公司；RS-JR80A绞肉机，荣事达三洋电器股份有限公司；RADWAG WTC 2000电子天平，上海卡耐兹实验仪器设备有限公司；HE 53水分测定仪，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SE-A6全自动脂肪测定仪，阿尔瓦仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猪肉饼制作

参照李颖等[18]的方法，用装配有直径6 mm、3 mm孔径的绞肉机将新鲜猪后腿肉绞碎成肉糜并混合均匀，以培养皿为模具，按表1配方制作重约45 g的猪肉饼，置于塑料盘用PVC膜包裹，放入4 ℃冰箱冷藏，于1、3、5、7 d取样测定猪肉饼品质的变化。

表1 肉饼配方Table 1 Pork patties formula

1.3.2 pH值测定

准确称取(3.00±0.20) g肉饼置于50 mL离心管中，用玻璃棒捣碎后准确加入15 mL 0.15 mol/L NaCl溶液，均质机低速均质20 s(每10 s暂停1次，每次间隔5 s)。用PHS-25数显pH计测定各组样品pH值。每组样品设置3个平行。

1.3.3 蒸煮损失率的测定

参照李颖等[18]的方法，蒸煮前、后猪肉饼的重量分别计为M1、M2，蒸煮损失率计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 色差分析

参照曹云刚[19]的方法，选取厚度约1.5 cm的生肉饼，将色差仪进行零校正、白板校正后测定猪肉饼的亮度L*、红度a*和黄度b*。

1.3.5 质构分析

参照李梦琪[20]的方法，采用质地剖面分析(texture profile analysis，TPA)，测定肉饼的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和恢复性。将测完蒸煮损失的熟肉饼切成高约1 cm，底面积约2 cm × 2 cm的方块状。探头型号为P/75，压缩比为20%，测试前及测试速度为2 mm/min，测试后速度为50 mm/s。

1.3.6 脂肪氧化分析

TBARs的测定：称取约1.5 g肉沫样品，并记录其准确质量M，每组样品中先加入1.5 mL 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)溶液[1%(质量分数) TBA溶于0.075 mol/L NaOH溶液]，然后加入8.5 mL 三氯乙酸(trichloroacteic acid，TCA)溶液[2.5%(质量分数) TCA溶于0.036 mol/L HCl溶液]，混合均匀后在100 ℃水浴下加热30 min，然后置于冰水浴中冷却至室温，吸取5 mL上清液于试管中加入5 mL氯仿，3 000×g离心15 min，吸取3 mL上清液于试管中，加入1.5 mL石油醚静置分层后取下层液体于532 nm测定吸光度值。每组样品设3组平行，并作空白对照。TBARs值计算如公式(2)所示：

(2)

式中：ABS为除去空白后样品组的吸光值。

1.3.7 蛋白氧化分析

肌原纤维蛋白的提取参照XIONG等[21]的方法，将各组样品用僵直液提取3次后，加入0.1 mol/L NaCl溶液匀浆后经纱布过滤除去残留的结缔组织，用0.1 mol/L HCl溶液将蛋白溶液pH值调至6.25，离心后所得蛋白沉淀即为肌原纤维蛋白。

羰基含量的测定参照杨玉玲等[22]的方法，将提取的肌原纤维蛋白稀释至约20 mg/mL，采用2,4-二硝基苯肼法测定蛋白羰基的含量。

总巯基含量的测定：将提取的肌原纤维蛋白用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液稀释至2 mg/mL，准确吸取0.5 mL样品溶液于试管中，先后加入2.0 mL 尿素-十二烷基硫酸钠溶液、0.5 mL 10 mmol/L 5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)溶液，混合均匀后，避光条件下反应15 min，于412 nm测定吸光值。

1.4 数据处理

每组实验重复2～3次，每次重复至少设置3个平行。所有实验数据统计分析采用Microsoft Excel软件，数据采用平均值±标准差表示，显著性分析采用Statistix 9软件(P<0.05)的一般线性模型程序进行方差分析，并采用最小显著差数法全配对多重比较，绘图采用Sigma plot 12.5软件。

2 结果与分析

2.1 不同处理对冷藏过程中猪肉饼pH的影响

肉及肉制品的pH值是反映其新鲜度的一个重要指标。不同处理对冷藏过程中猪肉饼pH值的影响如图1所示。整体来看，TSPP的添加显著提高了猪肉饼的pH值(P<0.05)，其他抗氧化剂添加对猪肉饼pH的影响不大(P>0.05)。随着冷藏时间的延长，各组猪肉饼的pH值都呈现上升趋势。冷藏第1～3天，各组肉饼的pH值增幅较大，其中对照和BHA组肉饼的pH值增幅尤为显著；冷藏3～7 d，各组肉饼的pH值变化趋势较为平缓。类似的，牛建章等[23]研究发现贮藏第2天开始牦牛肉的pH呈现明显上升趋势。在贮藏过程中，猪肉饼中蛋白质的水解及氧化产物，可能会导致细菌大量繁殖，而在大量微生物的作用下，蛋白质可能会进一步分解生成大量胺及氨类等碱性物质[24]，使冷藏1～3 d猪肉饼的pH值呈现增大趋势。整个冷藏期间，TSPP、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组肉饼的pH值始终高于对照、BHA和PPE组，这是由于TSPP是具有一定缓冲作用的碱性物质，添加到肉饼中会使其pH增大。

图1 不同处理对冷藏过程中猪肉饼pH的影响Fig.1 Effect of different treatments on pH value of pork patties during cold storage

2.2 不同处理对冷藏过程中猪肉饼蒸煮损失的影响

TSPP是目前应用十分广泛的一种磷酸盐[25]，应用于肉及肉制品的加工中可以明显提高肉品的保水性能、改善肉品品质[26]。不同处理对冷藏过程中猪肉饼蒸煮损失的影响如图2所示。在冷藏过程中，对照组肉饼的蒸煮损失率呈现不断增大的趋势，另5组处理肉饼的蒸煮损失率较为稳定。BHA和PPE添加组肉饼的蒸煮损失率约为9%，在贮藏后期明显低于对照组。这可能是由于BHA和石榴皮提取物在一定程度上抑制了肉饼中的脂肪和蛋白质氧化变性，因而降低了其蒸煮损失。添加TSPP可以明显降低肉饼的蒸煮损失率，使贮藏期间的肉饼蒸煮损失率维持在8%左右。与本研究结果类似，王秀霞等[27]研究发现添加磷酸盐可以明显降低肉丸的蒸煮损失率。KILINC等[28]发现多聚磷酸盐(三聚磷酸钠、TSPP)的处理可以明显降低鳕鱼片的蒸煮损失率。磷酸盐可以通过影响静电荷效应使蛋白质网络结构松弛，提高保水性；TSPP可以调节肉饼的pH，使蛋白远离其等电点(猪肉肌原纤维蛋白的等电点约为5.3)，静电荷数增加，水合作用增强；此外，TSPP的添加可以增强肉饼体系的离子强度，有利于肌球蛋白的溶出，提高其吸水性和肉饼的保水性能[29]。因此，在冷藏过程中添加TSPP的肉饼蒸煮损失率远低于其他组。

图2 不同处理对冷藏过程中猪肉饼蒸煮损失的影响Fig.2 Effect of different treatments on cooking loss of pork patties during cold storage

2.3 不同处理对冷藏过程中猪肉饼色差的影响

猪肉饼的色泽是评价其品质、体现其新鲜度的重要指标[19]，是消费者的首要感官印象。不同处理对冷藏期间猪肉饼色差的影响如图3所示。冷藏过程中，对照、BHA和TSPP组猪肉饼的亮度值接近，为55～57，而添加石榴皮提取物的PPE、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组猪肉饼的亮度值为51～54，明显低于以上3组。猪肉饼在冷藏过程中，肉饼内部的水分可能渗出至肉饼表面，对光的反射能力增强，所以对照、BHA和PPE组的亮度值略有增大，TSPP可以提高肉饼的保水性能，防止肉饼中水分流失渗出表面，因而其亮度值在贮藏期较为稳定[30-31]。6组肉饼的红度值随冷藏时间的延长均呈现显著下降趋势，其中对照组红度值最高，BHA和TSPP单独添加对肉饼红度值的影响不明显，但添加石榴皮提取物的PPE、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组猪肉饼的红度值明显低于对照组。BHA和对照组的黄度值在冷藏过程中呈现下降趋势，分别由17.96和17.32降低至16.53和16.14。TSPP、PPE、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组肉饼的黄度值在整体冷藏期间均低于对照组，且表现为黄度值在3～5 d呈现下降趋势，之后降低幅度减缓。猪肉饼的色泽与血红蛋白和肌红蛋白的状态密切相关，当呈色部分——血红素辅基处于还原状态时肉呈现鲜红色，被氧化后肉色变暗呈现褐色[32]。综合蛋白氧化的实验结果，D-VCNa和TSPP对肉饼蛋白氧化抑制效果不明显，石榴皮提取物富含多酚、黄酮类物质，具有良好的抑制蛋白氧化作用，可能对血红素辅基产生影响，但PPE本身为棕黄色，颜色较深，因此PPE、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa对肉饼色差的影响是其对蛋白氧化稳定性及PPE自身颜色影响综合作用的结果。总的来看，在本实验条件下，抗氧化剂添加对肉饼色泽具有一定的负面影响。

2.4 不同处理对冷藏过程中猪肉饼质构特性的影响

不同处理对冷藏过程中猪肉饼质构特性的影响如表2所示。对照、BHA和PPE组的猪肉饼在冷藏过程中硬度均呈现先增后减的趋势，且整体来看3组肉饼硬度值较为接近，说明BHA及PPE添加对肉饼硬度影响不大。TSPP、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组猪肉饼的硬度明显低于其他3组，且整个储藏期内较为稳定，均保持在1 000 g左右，说明添加TSPP可以在一定程度上稳定猪肉饼的硬度变化。6组处理肉饼在冷藏前期(1～3 d)的弹性、内聚性、咀嚼性和恢复性较稳定，在第3～5天呈现急剧下降趋势，此后下降趋势减缓。整体来看，对照组肉饼在冷藏期间的弹性、内聚性、咀嚼性和恢复性最低，抗氧化剂添加对于肉饼质构特性的恶化具有一定的抑制作用，但效果有限。

表2 不同处理对冷藏过程中猪肉饼质构特性的影响Table 2 Effects of different treatments on texture characteristics of pork patties during cold storage

2.5 不同处理对冷藏过程中猪肉饼脂肪氧化的影响

肉及肉制品中富含脂肪和蛋白质，在冷藏过程中容易发生氧化，导致腐败变质[33]。在冷藏过程中，脂肪氧化成氢过氧化物，进一步分解成小分子的醛、酮、酸等物质[34]。TBARs值表示1 kg肉中丙二醛(malondialdehyde，MDA)等醛类有害物质的含量，用来反映脂肪氧化的最终程度[35]。不同处理组肉饼的TBARs值在冷藏过程中的变化趋势如图4所示。在整个贮藏期内对照组肉饼的TBARs值最大，说明其脂肪氧化最为严重；对照组的TBARs值在1～5 d内持续增大，但随后有所降低，可能是由于氧化反应生成的活泼醛类物质与蛋白质氨基酸活性基团发生了反应[36]。BHA和TSPP组肉饼的TBARs值非常接近，说明TSPP和BHA对肉饼中脂肪氧化的抑制效果相当。这是由于TSPP具有一定的金属离子螯合作用[37]，而BHA具有优良的自由基清除能力，均可以减缓脂肪氧化。石榴皮提取物添加组(PPE、PPE+TSPP、PPE+TSPP+D-VCNa)肉饼的TBARs值在整个冷藏期间变化不明显，均保持在0.26 mg/kg以下，表明石榴皮提取物对脂肪氧化的抑制效果远高于TSPP和BHA，几乎完全抑制了脂肪的氧化。这主要是由于石榴皮提取物富含多酚类物质具有高效的·OH、ABTS自由基、DPPH自由基清除能力和一定的Fe2+螯合能力[14]。与本实验结果类似，曹云刚等[37]研究发现PPE对猪肉饼脂肪氧化有显著的抑制作用，且抑制效果与石榴皮提取物添加浓度呈正相关。

图4 不同处理对冷藏过程中猪肉饼脂肪氧化的影响Fig.4 Effect of different treatments on fat oxidation of pork patties during cold storage

2.6 不同处理对冷藏过程中猪肉饼蛋白氧化的影响

蛋白氧化也是导致肉及肉制品品质劣变的重要原因。蛋白羰基化和氨基酸残基中巯基向二硫键转化都是反映蛋白氧化程度的重要指标[38]。冷藏过程中不同处理组的总羰基含量和总巯基含量变化如图5所示。

a-总羰基含量；b-总疏基含量图5 不同处理对冷藏过程中猪肉饼蛋白氧化的影响Fig.5 Effect of different treatments on protein oxidation of pork patties during cold storage

对照、BHA和TSPP组的猪肉饼在冷藏期间羰基含量值较为接近，变化趋势也基本一致，在1～3 d内迅速上升，此后持续降低，可能是由于新生成的羰基与亲核物质产生羰氨缩合反应[39]以及氨基酸残基中的醛基被氧化成羧基[40]。对照组羰基含量最高，BHA和TSPP能够在一定程度上抑制蛋白质羰基化反应。PPE添加组(PPE、PPE+TSPP、PPE+TSPP+D-VCNa)肉饼的羰基含量明显较低，在整个冷藏期呈缓慢上升趋势，说明PPE可以显著抑制蛋白羰基的生成；PPE、PPE+TSPP和PPE+TSPP+D-VCNa组羰基含量接近，说明抗氧化剂复配对于抑制蛋白羰基生成无协同作用。

蛋白质中巯基具有较高的反应活性，容易发生氧化生成二硫键，导致巯基含量降低[34]。在整个冷藏过程中，所有处理组蛋白总巯基含量变化趋势基本一致，随冷藏时间延长整体呈下降趋势，在1～5 d下降缓慢，随后迅速下降。总体来看，单独添加TSPP无法抑制巯基含量的降低；添加BHA、PPE、PPE+TSPP、PPE+TSPP+D-VCNa可以在一定程度下减缓总巯基含量的下降，其中PPE+TSPP+D-VCNa效果最好，且在冷藏前期(1～5 d)抑制效果较好，冷藏后期效果较差。综上所述，PPE+TSPP+D-VCNa组合在抑制猪肉饼冷藏期内脂肪及蛋白氧化方面综合效果最好。

3 结论

TSPP的添加在一定程度上提高了猪肉饼的pH和保水性能，使肉饼在蒸煮过程中汁液损失率降低，进一步改善了肉饼的质构特性。TSPP具有一定的金属离子螯合作用，可以显著抑制猪肉饼中脂肪的氧化，其抑制效果与BHA相近。PPE具有良好的抗氧化性能，可以显著抑制猪肉饼的脂肪氧化、蛋白羰基化以及巯基含量降低。整体来看，PPE+TSPP 及PPE+TSPP+D-VCNa组合在改善肉饼品质及氧化稳定性方面综合效果最好。