斑点叉尾鮰鱼下脚料蛋白提取工艺的响应面法优化研究

陈紫红，黄茂坤

我国水产养殖居世界前列，2019 年全国水产品产量高达6 450 万吨［1］.在水产加工过程中出现大量的下脚料，约占鱼体质量的70%，这些鱼头、鱼皮等下脚料含有丰富的胶原蛋白，大多被丢弃，造成了严重的环境污染［2］.斑点叉尾鮰鱼（Channel Catfish）富含蛋白质和多种不饱和脂肪酸，具有增强免疫力和降血脂等功效［3］.冷冻鱼片是目前绝大多数鮰鱼进行初加工的方式，但这种加工方式会产生大量的下脚料，致使资源浪费和生产成本提高［4］.

大量实验表明，水产品的蛋白含量丰富，其在抑菌、抗氧化以及抗疲劳等方面作用显著［5-7］.目前常用的提取蛋白方法主要有超声辅助法、酶法、碱提酸沉法等，其中，碱提酸沉法易于操作且所需仪器设备简单，更适用于水产品优质蛋白的工业化生产［8-10］.

利用蛋白易溶于碱性溶液从而提高蛋白提取率的特点，本研究采用碱提酸沉法提取鮰鱼下脚料蛋白，以蛋白提取率为指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法的中心组合设计优化提取蛋白的工艺条件，建立提取工艺与鮰鱼蛋白提取率之间的数学模型，以期获得最优的蛋白质提取工艺参数，旨在为斑点叉尾鮰鱼下脚料的高值化利用及相关产品的研发提供新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜斑点叉尾鮰鱼购于泉州市丰泽区石头街菜市场；牛血清蛋白、考马斯亮蓝均购于上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、磷酸和氢氧化钠等试剂均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司.

1.2 仪器与设备

ME 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PE20 型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H1650 型台式高速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DS-7510DT 超声波清洗器，上海生析超声仪器有限公司.

1.3 实验方法

（1）蛋白提取.将鮰鱼下脚料进行冻干粉碎后，将冻干鱼粉按照一定的比例配成溶液，调节碱性pH，置于恒温振荡器中反应一定时间，取出离心，在8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液，调节pH 至蛋白质等电点4.0，静置12 h 离心取沉淀，低温烘干测定蛋白含量.

（2）蛋白含量的测定.选用凯氏定氮法测定鮰鱼蛋白质的含量［11］，选用考马斯亮蓝法测定粗提液中的蛋白质含量［12］.

（3）单因素实验.以蛋白提取率为指标，分别考察料液比、碱提pH 和碱提温度对鮰鱼蛋白提取率的影响，考察各因素影响的显著性及最优水平.

①料液比对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.称取鱼粉，分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 料液比加入蒸馏水，调节pH 至10，置于恒温振荡器中，在50 ℃下反应2 h 后，取出反应液，在8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液调节pH 至4.0，静置12 h 离心取沉淀，低温烘干测定蛋白含量.

②碱提温度对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.称取鱼粉，按照1∶20 的料液比配成提取液，调节pH 至10，分别置于恒温振荡器中，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下反应2 h后，取出反应液，在8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液，调节pH 至4.0，静置12 h 离心取沉淀，低温烘干测定蛋白含量.

③碱提pH 对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.称取鱼粉，按照1∶20 的料液比加入蒸馏水，调节pH 分别至9、10、11、12、13，置于恒温振荡器中，在50 ℃下反应2 h 后，取出反应液，在8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液调节pH 至4.0，静置12 h 离心取沉淀，低温烘干测定蛋白含量.

1.4 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，选取影响显著的因素，采用Design-Expert 8.0 软件的Box-Behnken 方法设计响应面优化实验，建立各因素及其交互作用与蛋白提取率之间的数学模型，探讨料液比（A）、碱提pH（B）、碱提温度（C）及其交互作用对蛋白提取率的影响，寻找最优的蛋白提取工艺，实验因素与水平见表1.

表1 中心组合实验因素水平编码表

1.5 标准曲线的制作

采用杨正坤等人［13］的研究方法进行牛血清蛋白标准曲线的制作.以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，进行标准曲线的绘制，得线性回归方程为y=1.882 9x+0.260 6（R2=0.992 9）.

1.6 数据统计方法

文中所有数据均取三次重复实验的平均值，采用Excel 软件对数据进行分析，采用Origin 7.5 软件作图.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

（1）料液比对于鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.料液比对鮰鱼下脚料的蛋白提取率影响如图1 所示.

图1 料液比对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响

由图1 可知，当料液比在1∶10 到1∶20 之间时，鮰鱼蛋白的提取率呈现上升趋势，当料液比超过1∶20，蛋白提取率出现大幅降低后趋于平缓的趋势.当料液比低于1∶20 时，由于反应液的浓度较大，分子间作用力增强，导致分子扩散速率较低，影响反应液中蛋白质的溶出，降低了蛋白提取率［14］.当料液比过大时，蒸馏水含量的增加导致蛋白质表面的亲水基团形成了一个水化层，使蛋白质颗粒间隔距离增大，影响蛋白质的沉淀效果，从而导致蛋白提取率的降低［15］.因此，料液比以1∶20为宜.

（2）碱提温度对于鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.碱提温度对鮰鱼下脚料的蛋白提取率影响如图2 所示.由图2 可知，随着温度升高，鮰鱼下脚料蛋白提取率也随之增大，当温度超过40 ℃时，呈现明显的下降趋势.当温度低于40 ℃时，温度较低，反应速度较慢，随着温度的上升，分子间运动加剧，有效碰撞次数增多，反应速率的提升导致提取率的上升，这与卫萍等人［16］的研究结果是一致的.蛋白提取率在40 ℃时达到29.5%的最高值，当温度超过40 ℃时，高温会破坏蛋白质的空间构象，蛋白质疏水基团展开暴露，蛋白质变性使提取率下降［17］.因此选取40 ℃为后续的碱提温度.

图2 碱提温度对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响

（3）碱提pH 对于鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响.碱提pH 对鮰鱼下脚料的蛋白提取率影响如图3 所示.由图3 可知，鮰鱼下脚料的蛋白提取率随着碱提pH 的上升呈现先升高后下降的趋势.在碱提pH 为11 时，蛋白提取率高达65.48%.在碱 提pH 处于9～11 的 范围时，提取率随着碱提pH 的升高而升高，此时鮰鱼蛋白中的负电荷在碱性条件下使得蛋白分子相互排斥，分散均匀，溶解度提高，致使提取率呈现上升的趋势［18］，当碱提pH 过高时，强碱会导致蛋白质变性或者过度水解，从而使蛋白提取率下降.因此，选取碱提pH为10、11、12 这三个水平进行响应面的优化实验.

图3 碱提pH 对鮰鱼下脚料蛋白提取率的影响

2.2 响应面法优化实验结果分析

根据单因素实验确定各因素的最佳范围，采用Box-Behnken 中心组合设计3 因素3水平的响应面优化实验，对影响鮰鱼下脚料的蛋白提取率的3 个因素：料液比、碱提温度和碱提pH 进行响应面实验分析，响应面分析及结果见表2.

表2 中心组合实验设计结果

采用Design-Expert 8.0 软件进行数据方差分析，结果见表3.该模型的P值<0.000 1，回归模型显示差异显著，而失拟项的P值为0.305 6，大于0.05，表明失拟项不显著，可用该模型预测分析实验结果.模型的一次项和平方项极显著（P＜0.01），交互项不显著（P＞0.05），说明各因素的交互作用对鮰鱼下脚料蛋白提取率影响不显著.从表中F值可以看出，各因素对于提取率的影响为碱提pH>温度>料液比；采用所建模型进行参数最优分析，相关系数R2=0.945 4 大于0.9，说明该回归方程的相关度较好，自变量与响应值之间线性关系相对显著，斑点叉尾鮰鱼下脚料蛋白提取后的提取率变化94.54%来源于所选变量；失拟项P>0.05，表明该回归方程能够较好地拟合真实的响应面，可以使用该模型来分析响应值的变化.

为了验证模型的准确性，采用所建模型进行参数最优分析，得出斑点叉尾鮰鱼下脚料的蛋白提取最优工艺条件为料液比为1∶19.13、碱提pH 为11.39、碱提温度为37.84 ℃，在该条件下预测的提取率为84.85%，为适应具体操作，调整条件为料液比1∶20、碱提pH 11.4、碱提温度38 ℃，验证后的水解度为82%±0.34%，与预测值接近，可见该模型可用于实践.

3 讨论与结论

利用碱提酸沉法提取动物优质蛋白，耗时短且操作便捷，是蛋白提取的常用方式.有研究利用碱提酸沉法提取的如鲢鱼［19］、罗非鱼［20］、鹅肝［21］、磷虾［22］等的蛋白质，并对提取条件进行优化，发现蛋白提取影响因素与本试验基本一致，但不同动物源蛋白的最优提取条件却不尽相同，如鲢鱼的最佳碱提pH 是12.0，而磷虾的最佳浸提pH 是13.0.出现这种差别的原因可能是不同原料中的蛋白含量和性质不同，从而影响蛋白提取条件.

斑点叉尾鮰鱼在经过切片加工后产生大量的下脚料被丢弃，综合利用不充分，造成了环境污染和资源浪费，也导致了生产成本的增加.本试验以斑点叉尾鮰鱼下脚料为研究对象，蛋白提取率为指标，从料液比、碱提pH和碱提温度三个方面筛选出了斑点叉尾鮰鱼下脚料蛋白提取的最佳工艺，在单因素实验的基础上，采用Box-Benhnken 响应面法优化斑点叉尾鮰鱼下脚料蛋白提取的工艺参数，建立了关于提取率的预测模型.结果表明：各因素对蛋白提取率的影响依次为碱提pH>碱提温度>料液比，斑点叉尾鮰鱼下脚料提取的最优工艺条件为料液比1∶20、碱提pH 11.4、碱提温度38 ℃，在此条件下，斑点叉尾鮰鱼下脚料蛋白质提取率高达82%±0.34%.本提取工艺可为斑点叉尾鮰鱼下脚料的高值化利用及附加产品的开发提供参考，为鮰鱼的产业增值提供新的技术支持.