黄芩素对感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠的影响

徐 晴，杨翰文，王思齐，陈啟艳，张 玲*

（1．锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121001；2．锦州医科大学基础医学院，辽宁 锦州 121001）

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium，STM）属于人、畜共患病原菌。由STM所引发的大规模食物中毒事件在国内外均有发生[1]。虽然STM感染健康成年人所引起的症状多为自限性，较易控制和治疗，但对于免疫功能尚未发育完全的幼儿、免疫力与身体机能下降的老人和免疫系统受损的病人来说，感染STM却有致命性[2]。黄芩素，化学名称5，6，7-三羟基黄酮，又名百可利（baicalein），是植物黄芩（Scutellaria radix）中含量最高的黄酮类化合物之一。研究表明，黄芩素具有较强的抗微生物[3]、抗炎、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、保护心血管系统等作用[6]，对大肠杆菌、尖孢镰刀菌、白色念珠菌等有显著的抑制作用[7-8]。本课题组前期体外研究发现，黄芩素对STM有显著抑制作用[9]。本试验观察黄芩素对感染STM小鼠的影响，为抗STM感染提供新的治疗方案，为丰富该药的药理作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

鼠伤寒沙门氏菌标准株（ATCC14028）购自中国医学微生物菌种保藏中心（National Center for Medical Culture Collection，CMCC）。

1.1.2 试验试剂

黄芩素（批号：20190820）购自西安开来生物工程有限公司（纯度为98%），取适量甲醇溶解、蒸馏水稀释，超净台内过滤后备用；亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）与SS琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA检测试剂盒购自安诺伦（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 试验动物

健康昆明小鼠，雌、雄各半，体重 26～28 g，购自锦州医科大学实验动物研究中心。

1.1.4 试验仪器与设备

SW-CJ-2F双人双面超净工作台购自苏州净化设备有限公司；THZ-300恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；酶标仪购自美国伯乐iMark公司；精密电子天平购自Sartorius公司。

1.2 试验方法

1.2.1 STM悬液制备

将鼠伤寒沙门氏菌接种于SC培养基中，恒温摇床培养12 h，划线在SS琼脂平板上。恒温培养后，挑取典型STM菌落，再次接种于液体培养基中过夜培养。次日用PBS调整菌液浓度至OD600nm处吸光值为1.7，离心、洗涤、备用。

1.2.2 试验动物分组

健康昆明小鼠80只，饲养环境保持安静，通风良好，自由采食、饮水。经1周适应性饲养后，随机分为4组，每组20只。空白组、STM组、黄芩素+STM组和黄芩素组。分组后第1 d，空白组和黄芩素组小鼠灌服生理盐水（NS）0.2 mL/只，其余2组小鼠灌服浓度为1×107CFU鼠伤寒沙门氏菌液0.2 mL/只，灌胃后2 h恢复饲料和饮水的供应。第2 d，空白组和STM组小鼠3次/d灌服NS，每次0.2 mL/只；黄芩素+STM组和黄芩素组小鼠按20 mg/kg灌服黄芩素，3次/d。连续灌胃10 d后，观察各组小鼠存活情况，计算各组存活率。

1.2.3 血清细胞因子的测定

摘除小鼠眼球收集血液于1.5 mL离心管中，室温静置1～2 h；3 000 r/min离心10 min，吸取上清，迅速移至-80 ℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8的水平。

1.2.4 脏器指数的测定

小鼠断颈处死，去尽肝脏和脾脏表面的结缔组织，称量脏器重量，计算各脏器指数。

1.2.5 组织切片的制备

剪取小块肝脏和脾脏组织，PBS清洗，置于4%多聚甲醛中，室温固定，常规石蜡包埋和HE染色。

2 结果与分析

2.1 黄芩素对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠存活率的影响（见图1）

空白组和黄芩素组小鼠生长状态良好、毛发光泽顺滑、精神状态活泼、进食量正常、未见死亡。STM组小鼠感染后，小鼠毛发凌乱无光泽、精神萎靡不振且嗜睡、进食量明显减少，并于感染后第5 d开始出现死亡。由图1可知，5～10 d的存活率分别是80%、70%、60%、45%、30%和25%。黄芩素+STM组小鼠毛发凌乱无光泽、精神萎靡、进食量略微减少，第7 d开始出现死亡。由图1可知，7～ 10 d的存活率分别是90%、75%、65%和60%。

2.2 黄芩素对感染小鼠血清炎性因子的影响（见表1）

表1 黄芩素对感染小鼠血清中炎性因子的影响（n=5）Tab.1 The effect of baicalein on inflammatory factors in the serum of infected mice 单位：ng/L

由表1可知，STM组的4种炎性因子水平均较空白 组有显著提高（P＜0.01）；黄芩素+STM组中的炎性因子水平均极显著低于STM组（P＜0.01）；而黄芩素组的炎性因子水平与空白组无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 黄芩素对感染小鼠脏器指数的影响（见表2）

由表2可知，STM组中小鼠的肝脏和脾脏指数极显著低于空白组（P＜0.01）；黄芩素+STM组的肝脏和脾脏指数显著高于STM组（P＜0.05），但与空白组仍有差异（P＜0.05或P＜0.01）；黄芩素组的2个脏器指数与空白组无显著差异（P＞0.05）。

表2 黄芩素对感染小鼠脏器指数的影响（n=5）Tab.2 The effect of baicalein on the organ index of infected mice 单位 ：%

2.4 黄芩素对感染小鼠肝脏和脾脏组织的学影响（见图2、图3）

由图2可知，空白组小鼠肝小叶结构完整，肝窦清晰、较宽，肝上皮细胞排列整齐、呈多边形，细胞质均匀红染、细胞核清晰；STM组可见一脓腔、肝细胞排列紊乱、细胞核固缩、细胞质部分区分不明显、肝小叶内见小坏死灶、有的呈无结构均质红染、中央静脉和窦状隙扩张、有充血出血，窦状隙内有中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润。与STM组相比，黄芩素+STM组肝小叶结构相对完整、细胞变性数量及程度逐渐降低、肝小叶内坏死灶数量减少、坏死程度减轻、中央静脉和窦状隙扩张程度减小；黄芩素组的肝脏组织结构与空白组类似。

由图3可知，空白组小鼠的脾脏被膜和小梁结构完整、红髓和白髓界限清晰、细胞形态大小正常；与空白组相比，模型组脾脏的被膜明显增厚、脾小梁增宽、髓质区可见明显淀粉样物质沉积、白髓面积明显减少、红髓内有相当程度的淋巴细胞弥漫性增生和浸润现象；与模型组相比，黄芩素+STM组的脾脏被膜变薄、脾小梁变窄、白髓大小和形态接近正常、组织间隙有大量血细胞；黄芩素组的脾组织形态与空白组接近。

3 讨论

STM主要存在于动物机体消化道内，通过粪便可在动物之间、动物和人之间广泛传播。近年来，由于抗菌药物的大范围使用，多重耐药株的出现已成为临床治疗STM感染面临的严峻问题[10]。目前，尚未见到细菌对中药抗菌成分出现耐药性的报道。因此，寻找抗STM的有效中药为该病的防治提供新思路。本试验结果表明，黄芩素对STM感染的小鼠具有很好的治疗效果。

作为活化细胞产生的小分子多肽类物质，TNF-α是参与机体免疫应答和炎性反应的重要介质[11]。IL-1则是由单核细胞产生的多肽，可分为IL-1α和IL-1β两种异构体。IL-1β广泛参与组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程[12]。IL-6是机体受到炎症刺激后，由单核巨噬细胞、B细胞、T细胞核内皮细胞等分泌的糖蛋白，具有多种生物学效应，也是导致机体组织或器官严重损伤的重要因子[13]。IL-8属于一种炎症趋化因子，可促进嗜中性多形核白细胞与其结合，释放出大量氧自由基和溶酶体，继而诱发炎症反应[14]。本研究发现，与空白组相比，STM使感染小鼠的存活率明显下降，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量明显增高，脏器指数则显著降低（P＜0.01），肝脏和脾脏组织呈现明显的病理改变。与STM组相比，黄芩素使感染小鼠的存活率明显升高，小鼠血清中炎性因子水平显著降低，脏器指数显著提高（P＜0.05），肝脏和脾脏的病理变化有明显改善。上述结果说明，黄芩素可通过降低炎性因子水平、改善肝脏和脾脏的病理变化提高感染STM小鼠的存活率。黄芩素组的各项指标均与空白组接近，且无统计学差异，说明黄芩素对正常小鼠无影响。

4 结论

本试验研究表明，黄芩素对STM感染小鼠的存活率、炎性因子水平、脏器指数、肝脏和脾脏的组织变化均有改善作用。