利用同源重组技术构建Chordin 基因载体及其在成纤维细胞中表达量的研究

刘开东，荣 恒，贺建宁，张梦瑶，赵 明，柳 楠*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛 266000；3.青岛市动物疫病预防控制中心，山东青岛 266000）

羊毛是毛囊的衍生物，毛囊是表皮向内凹陷，通过相互作用，在各种信号通路的协作下形成的[1]。近年来随着人们对羊毛质量要求的提高，对毛囊的研究显得尤为重要[2]。敖汉细毛羊是我国知名的肉毛兼用羊，具有羊毛细、柔软度高、体格大等特点，是理想的研究对象[3]。在模式小鼠中，Puas 等[4]在20 年前对于毛囊的发生发育给出一套分类方法，将其分为3 个时期8 个阶段；随着近些年遗传学手段及二代测序技术的发展，Sexna[5]将原本的分类方法进行改进，划分为10 个阶段。关于羊毛囊的研究目前主要集中在出生后和成年绵羊身上[6]。Stenn 等[7]在成年绵羊身上对毛囊的周期性生长变化展开研究；柳楠等[8]在分子水平上研究了敖汉细毛羊羊毛性状形成的机理；王小佳等[9]在分子水平上探究了羊毛的生长部位。大多数研究都集中在分子水平上，而在细胞水平上与毛囊生长发育相关的研究甚少。因此，本研究通过对其质粒的构建及转染成纤维细胞来进行Chordin基因表达量的分析，为该基因在个体水平上的研究提供基础。

Chordin基因是骨形态发生蛋白信号通路中的拮抗剂[10]，Chordin 蛋白与BMP2和BMP6的亲和力较强，能够与TSG、BMP 结合形成蛋白三聚体[11]，进而阻止BMP2和BMP6与其受体的结合[12]。许多研究表明，BMP 家族中基因抑制毛囊发育[13]，Chordin作为此家族的拮抗剂，能够间接促进毛囊发育。早期研究表明，BMP 信号通路对毛囊的形态发生及周期性发育有重要的调控作用，秦波等[14]研究发现在团头鲂胚胎发育的各个时期都可检测到Chordin基因，其对胚胎早期发育起到了重要的调控作用。Chordin基因在12 个组织中的脑组织表达量较高，推测其参与了脑组织发育过程，对神经系统的发育有较大影响[15]。由此推断Chordin基因可以通过与BMP 结合进而对毛囊发育过程起调控作用。

目前，关于Chordin调控机制研究主要集中在人类、小鼠、斑马鱼等动物中，在细毛羊中与毛囊相关的研究较少。因此，本实验以敖汉细毛羊为研究对象，采集40 日龄的胎羊，通过对Chordin基因表达载体的构建，利用实时荧光定量PCR 和Western Blot 等技术分析其转染成纤维细胞后表达量的变化，旨在为Chordin基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取40 日龄的健康胎羊（由青岛畜牧所奥特种羊场提供）并及时消毒处理。TRIZol（Roche）试剂、蛋白裂解液、EcoRI限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、pcDNA3.1 质粒、DH5α感受态细胞、DMEM（基础培养基）、胰蛋白酶、标准胎牛血清、DPBS（磷酸缓冲盐溶液）、Lipofectamine 2000、反转录试剂盒、SoSo 试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、培养皿等均购自青岛尚赛科贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 从组织中提取RNA 并反转录成cDNA。在绵羊Chordin基因序列（登录号为XM-027957560.1）CDS 区外侧通过Primer 5.0 设计引物，并在上游引物和下游引物的5' 加入同源臂。完成后的引物序列为：F：5'-TTTAAACTTAAGCTCGGAATTCCC CCAGCTGTCCCGTTCG-3'；R：5'-TGGATCCGAGCTC GGCTAGGAGCCTTCATCTTCTTTCCCAGAC-3'。通过PCR 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，体系25 μL：DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，金牌Mix 22 μL。

1.2.2Chordin基因与pcDNA3.1 质粒同源重组对pcDNA3.1 质粒进行EcoRI单酶切，酶切体系为：EcoRI1 μL、pcDNA3.1 5 μL、Buffer 5 μL、ddH2O 39 μL，置于37℃金属浴中2 h。电泳检测后，通过切胶回收试剂盒纯化Chordin基因及切开的pcDNA3.1，通过T4 DNA连接酶进行连接，10 μL 体系：Chordin基因1 μL、pcDNA3.1 1 μL、SoSo 5 μL、ddH2O 3 μL，置于50 ℃金属浴10 min。之后转至DH5α感受态细胞，选取摇菌后的单菌落对其进行阳性率测定，经测序、质粒提取最终获得阳性质粒[16]。

1.2.3 成纤维细胞的培养 在羊场取40 日龄胎羊，用75% 酒精清洗2 遍，而后转至实验室，在培养皿中用75% 的酒精再次清洗3 遍，最后用含有双抗的PBS 反复清洗3 遍。用剪刀剪掉头部和四肢，然后将躯干在体视镜下剪成1.5 mm3左右（米粒大小），将其放在培养皿，加胎牛血清，在CO2浓度为0.05、温度37℃的培养箱中培养4 h，再加培养液。从培养箱拿出24 h 后，用PBS 冲洗干净，更换培养液，定时观察。细胞生长到95%左右进行传代培养[16]。

1.2.4 细胞转染 原代培养后传至第二代（P2）。用Lipofectamine 2000 进行瞬时转染，实验组、对照组分别加20 μL 脂质体试剂和480 μL DMEM（不含双抗），混匀，静置10 min，在实验组中加入40 μL 构建好的表达载体和460 μL DMEM（不含双抗），对照组仅加入500 μL DMEM，静置20 min，然后将实验组和对照组都移到培养皿中均加入4 mL DMEM，在37℃的温度条件下，培养6 h 后换液，之后培养36 h[16]。

1.2.5 细胞转染后的RT-PCR 扩大培养转染成功的单细胞，细胞在培养皿底部长到95%时，每个板加TRIZol（Roche）试剂3 mL，细胞裂解后进行RNA 提取。提取完成后，测定浓度和纯度符合标准后将其反转录成cDNA[17]。通过Primer Premier 5.0 软件设计Chordin和GAPDH基因的引物序列，完成后其引物序列见表1。

通过实时荧光定量PCR 反应测定表达量，实验组和对照组各3 次重复，Chordin相对于内参基因GAPDH的表达量用Ct（2-ΔΔCt）值法计算。利用SPSS 17.0 中t检验进行数据分析[17]。

1.2.6 细胞转染后Western Blot 将样品分为实验组和对照组，每组3 个生物学重复。先裂解提取细胞中的蛋白质，内参基因GAPDH、目的基因Chordin分别点3个胶孔，电泳后对蛋白质进行PVDF 转膜，用转膜电泳槽进行2～3 h，之后封闭蛋白质2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；按1:2 000 的比例对一抗进行稀释，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3 次，每次5 min。以1:2 000 的比例稀释二抗，孵育1.5 h，在暗室中曝光。用ImageJ 软件分析条带，结果用SPSS软件进行分析[17]。

表1 引物信息

2 结果

2.1Chordin目的基因扩增 图1 为PCR 扩增后凝胶电泳分析结果（2%琼脂糖凝胶），扩增条带位于2 874 bp 处，与已知大小一致。

图1 Chordin 基因PCR 扩增结果

2.2 pcDNA3.1 载体单酶切及纯化 图2 为pcDNA3.1 单酶切结果，1～2 酶切效果良好，pcDNA3.1 载体5 428 bp，与图中条带所吻合，可用于后续实验。

图2 pcDNA3.1 载体单酶切鉴定

2.3 表达载体pcDNA3.1 与目的片段重组及鉴定 如图3 所示，在2 874 bp 处有单一明亮的条带，为Chordin基因。菌液测序后用BLAST 比对，结果如图4 所示，碱基未发生突变，可用于后续实验。提取重组质粒，结果如图5 所示，1～2 为pcDNA3.1-Chordin重组质粒，重组后质粒大小为8 302 bp，与图中条带相符，表明重组质粒构建成功。

2.4 细胞培养 电子倒置显微镜下，定时观察。24 h 后细胞逐渐贴壁，组织块的四周逐渐有细胞游出。传代培养在细胞密度约为95%时进行，采用胰蛋白酶消化法，2 000 r/min 离心处理分离成纤维细胞，之后扩大培养，观察结果如图6 所示。

图3 菌液PCR 扩增结果

图4 测序比对

图5 重组质粒的提取

2.5 实时荧光定量PCR 检测mRNA 的表达 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，扩增的条带单一明亮，GAPDH产物大小为125 bp、Chordin产物大小为172 bp（图7），与已知大小均相同，可继续实时荧光定量PCR 实验。

图6 成纤维细胞原代、传代培养

图7 内参基因GAPDH（A）和目的基因Chordin（B）扩增产物

图8 Chordin 和GAPDH 熔解曲线（A）和扩增曲线（B）图

如图8 所示，Chordin和内参基因GAPDH的扩增曲线、熔解曲线清晰且只有一个峰值，结果表明在实时荧光定量PCR 过程中无二聚体且得到特异性的扩增产物，可用来进行定量分析。Chordin基因经过质粒构建转染成纤维细胞后其表达量极显著高于对照组（图10）。

2.6 Westren Blot 检测蛋白的表达 由图10 可知，转染的实验组条带明显比未转染的对照组粗，其灰度值由Image J 软件进行分析，结果用软件SPSS17.0 分析。由图11 可知，转染组Chordin基因蛋白的表达显著高于未转染的对照组，表明质粒pcDNA3.1-Chordin能高效表达Chordin基因。

图9 Chordin 基因mRNA 相对表达量

图10 Chordin 蛋白表达条带

图11 Chordin 蛋白相对表达量

3 讨 论

多种研究迹象表明，Chordin可作为BMP 基因家族的拮抗剂存在。Elisa[18]在牛中发现Chordin可以被BMP1和tolloid调节，其中BMP1对Chordin的调节具有抑制作用，但不能诱导骨形态发生过程。Kane 等[19]研究发现缺氧缺血性视网膜病变是视网膜新生血管形成的主要原因，低氧可诱导人视网膜周细胞中Chordin的表达，BMP6有效地参与了血管生成，Chordin在缺氧条件下可通过调节BMP6对内皮细胞的作用而对视网膜周细胞发挥作用，从而可以促进新生血管的形成。Fabian 等[20]实验发现可通过刺激BMP 通路保护肾脏免受急性或慢性损伤，Chordin特异性拮抗BMP7，BMP7在相邻的远端肾单位中表达，Chordin在人的缺血敏感S3 节段中表达，当该节段退变时，Chordin表达减少，BMP 信号的表达也相应减少。结果表明，Chordin与健康近端小管中的BMP7信号拮抗，降低其表达量，同时导致上皮损伤，损伤的上皮脱落能促进BMP7信号在上皮中再次表达，进而保护肾脏。Mikawa[21]等发现Chordin在大多数神经元以及它们的树突和轴突中被强烈表达，在高可塑性灰质的神经纤维中也观察到丰富的Chordin表达，例如小脑的分子层和上丘的浅层。Piccolo 等[22]在非洲蟾蜍体中发现Chordin 蛋白与BMP2和BMP6的亲和力较强，进而阻止了BMP2和BMP6与其受体的结合 。

Petrky 等[12]研究发现Chordin通过与BMP 结合而阻断其与受体结合，进而阻断BMP 信号通路。综上所述，Chordin可与BMP 特异性结合，干扰BMP 与其受体结合进而发挥调控作用，因此推测Chordin可以通过与BMP 结合进而对毛囊发育过程起调控作用。鉴于此，本实验通过对pcDNA3.1-Chordin载体的构建，通过其表达量的变化，在细胞层面上检测Chordin的功能，推断其与毛囊生长发育间的关系。

4 结 论

本研究通过对pcDNA3.1-Chordin载体的构建，通过实时荧光定量PCR、Western Blot 技术检测其转染成纤维细胞后的表达量，证实Chordin基因过表达，其mRNA 表达量和蛋白的表达量与对照组相比显著提高。