酵母发酵饲料对瘤胃菌群数量及多样性的影响

郝凌魁，刘世雄，李冬芳，于春微，李松建，陈 灰，高 民，胡红莲，刘大程*

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；3.内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

近几年生物饲料日益受到研究者关注。生物饲料不仅可以改善饲粮适口性、增强动物机体免疫功能、调节消化道微生态平衡、提高动物的生长性能，而且可以提高饲料的利用率、改善畜舍环境和降低饲料中的抗营养因子[1-4]。酵母发酵饲料为本课题组研制，由酵母菌为主的高活性菌株经液态富集培养、固态厌氧发酵及酵母破壁等发酵工艺生产而成，主要含有甘露聚糖、β-葡聚糖、多肽、有机酸和氨基酸5 种主效成分。前期试验表明酵母发酵饲料不仅能提高肉羊的采食量和生产性能，而且可以增强肉羊免疫功能和抗应激能力[5-9]。反刍动物瘤胃的功能是通过瘤胃微生物来实现的[10-11]，肉羊采食酵母发酵饲料后对瘤胃内主要功能菌的影响需要进一步阐明。基于此，本试验旨在研究酵母发酵饲料对瘤胃菌群数量的影响，为其在生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 酵母发酵饲料的制作 选取麸皮、玉米、棉籽粕、米糠、玉米胚芽粕、白玉米皮等原料作为发酵底物[5-6]。将活性酿酒酵母菌液（BC、XR4）以15%的接种量接入发酵底物中，加水使最终含水量为45%，然后进行固态堆积发酵。料高60 cm、发酵时间48 h、翻料控制发酵温度在35℃左右。其主要技术指标：葡聚糖≥145 mg/100g，甘露聚糖≥71 mg/100 g，多肽≥1.3 mg/g，氨基酸≥15.27 mg/100g，有机酸≥1.48 mg/g。

1.2 试验设计及日粮 选用10 只安装永久性瘤胃瘘管（内径4 cm）且体重约40 kg 的14 月龄蒙古羯羊，单笼饲养，自由饮水。将试验动物随机分为对照组和试验组，每组5 只羊。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+酵母发酵饲料，自由采食。课题组前期实践证明，酵母发酵饲料的最适添加范围是10%～15%[5]，本试验中添加量设计为日粮的13.37%。预试期15 d，正试期5 d，每天06:00 和18:00 饲喂。参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）配制试验饲粮。饲粮组成及营养成分见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 采集样品 预试期结束后，正试期开始采样，每天通过瘤胃瘘管在晨饲后0、3、6、9、12 h 采样，每天采集一个时间点，共采5 次。用无菌镊子夹取瘤胃内容物中的饲草料残渣，并用负压装置抽取瘤胃中上层的瘤胃液和食糜，共计50 mL。放入经无菌水冲洗的自动匀浆机中搅拌匀浆15 s，后装入无菌自封袋中，加入等体积磷酸缓冲液（pH 6.0，0.2 mol/L），冰浴拍打揉搓5 min，经2 层纱布过滤后4℃、1 000×g、15 min 离心取上清；所得上清液经4℃、10 000×g、25 min 再次离心后弃上清得沉淀加50 mL 缓冲液悬浮，经过液氮速冻后带回实验室-80℃保存。

1.3.2 实时荧光定量法的检测

1.3.2.1 DNA 基因组提取及PCR 扩增 采用磁珠法土壤和粪便基因组DNA 提取试剂盒（TIANGEN，DP712）提取样品基因组DNA，然后以其为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系：PCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 12 μL；反应条件：95 ℃，3 min 变性；95 ℃，30 s；Tm，30 s；72℃，延伸1 min，40 个循环。查找GenBank 中目的基因的序列，利用Primer premier 等基因编辑软件并结合参考文献[8]设计目的基因的引物和探针序列，PCR 引物、探针序列和退火温度见表2。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小后，采用胶回收试剂盒（AXYGEN，AP-GX-50）回收PCR产物。

表1 饲粮组成及营养成分（干物质基础）

1.3.2.2 qPCR 试验 实时荧光定量PCR 采用Taqman探针法绝对定量。根据目的片段大小，选用pMD-19T为载体质粒进行目的片段的连接，随后转化进入DH5-α感受态细胞，经Amp 抗性LB 平板鉴定含有各目的片段的阳性克隆菌落后，接种于LB 液体培养基（含Amp）中，37 ℃振荡过夜培养，用质粒小提试剂盒（TIANGEN，DP103）提取重组质粒。委托华大公司测序，在GenBank 上使用Blast 比对测序结果。利用分光光度计检测比对结果相符的各质粒的核酸浓度，以10 倍倍比稀释，作为标准品以制作标准曲线。

应用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time System 进行实时荧光信号值定量检测。反应体系总体积为50 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）25 μL，上、下游引物各（10 μmol/L） 1 μL，探针2 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.5 μL，DNA 模板4 μL，ddH2O 16.5 μL。反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s；Tm 34 s，40 个循环。

1.3.3 Illumina MiSeq 16S rRNA 高通量测序技术的检测根据E.Z.N.A.®soil 试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA,U.S.）对各样品进行DNA 抽提，用338F（5´-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3 ´）和806R（5´-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3´）引物对V3～V4 可变区进行PCR 扩增，扩增程序：95℃预变性3 min，27 个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR 仪：ABI GeneAmp®9700 型）。扩增体系为20 μL：4 μL Fast Pfu 缓冲液（5×），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL 引物（5 μmol/L），0.4 μL Fast Pfu 聚合酶；10 ng DNA 模板。

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2% 琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST （Promega，USA）进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300 的文库。利用Illumina 公司的 Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接，使用UPARSE 软件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根据 97%的相似度对序列进行 OTU 聚类；使用 UCHIME 软件剔除嵌合体。利用 RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。

1.4 统计分析 实验数据通过Excel 2010 整理后，使用SAS 9.0 统计软件进行单因素方差分析。结果以平均值± 标准差表示。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 差异极显著。

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR 结果

2.1.1 PCR 扩增结果 如图1 所示，各阳性克隆菌落所提取质粒扩增的PCR 产物条带单一，与各自对应的目的片段大小相符。进行序列同源性分析比对，相似性均大于99%，可满足后续实验要求。

表2 瘤胃细菌引物、探针及退火温度

图1 琼脂糖凝胶电泳图

2.1.2 荧光定量PCR 标准曲线方程 各菌的荧光定量PCR 标准曲线方程：Y溶纤维丁酸弧菌=-3.506logX+46.338；Y黄色瘤胃球菌=-3.637logX+46.800；Y产琥珀酸丝状杆菌=-3.586logX+49.889；Y埃氏巨型球菌=-3.616logX+49.603；Y白色瘤胃球菌=-3.341logX+41.441；Y栖瘤胃普雷沃氏菌=-3.341X+41.044；Y嗜淀粉瘤胃球菌=-3.319X+41.417；Y反刍兽甲烷短杆菌=-3.625X+44.434；Y牛链球菌=-3.282X+45.000。式中，X表示拷贝数，Y表示Ct 值，各方程的R2值均大于等于0.999。

2.1.3 荧光定量PCR 测定结果 由表3 可知，试验组的溶纤维丁酸弧菌在晨饲后3 h 数量最大（27.57×107copies/mL），且在晨饲后3、9、12 h 均高于对照组（P＜0.05）；但在晨饲后6 h 试验组中溶纤维丁酸弧菌数量低于对照组（P＜0.05）。试验组中黄色瘤胃球菌在晨饲后9 h 数量最大（4.32×107copies/mL），且在晨饲后6、9、12 h均高于对照组（P＜0.05）。试验组产琥珀酸丝状杆菌在晨饲后6 h 数量最大（4.27×107copies/mL），3、6 h 均高于对照组（P＜0.05）。试验组中埃氏巨型球菌的数量在晨饲后6 h（P＜0.01）、在晨饲后9 h（P＜0.05）高于对照组。试验组白色瘤胃球菌的数量最高值在晨饲后9 h（22.30×104copies/mL），高于对照组中的最高值（18.67×104copies/mL）（P＞0.05）。试验组中牛链球菌的数量在晨饲后3 h 高于对照组（P＜0.01）。在试验组中嗜淀粉瘤胃杆菌的数量与对照组差异不显著。试验组栖瘤胃普雷沃氏菌的数量在晨饲后3 h 和6 h 均高于对照组（P＜0.01）。试验组中反刍兽甲烷短杆菌的数量在晨饲后0 h 高于对照组，但在6 h 低于对照组中（P＜0.01），且3、9、12 h 均小于对照组的数量（P＞0.05）。

表3 荧光定量PCR 结果

2.2 Illumina MiSeq 16s rRNA 高通量测序结果

2.2.1 样本DNA 和测序数据评估 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量结果显示，提取的DNA 纯度良好，PCR产物目的条带大小正确，浓度合适。通过16S rRNA基因测序质控筛选后进行测序深度检测，所有样本的Shannon 稀释曲线显示曲线趋向平坦（图2），说明本次测序数据量足够大，已经基本覆盖到样品中所有的物种，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。

图2 Shannon 稀释曲线图（相似阈值为 97%）

2.2.2 Alpha 多样性分析 由表4 可知，试验组的Shannon指数低于对照组（P＜0.01）；试验组的Simpson 指数高于对照组（P＜0.05）；Sobs 指数、Ace 指数和Chao 指数在两组中没有显著差异。说明试验组的多样性显著低于对照组，而丰富度没有差异。

2.2.3 Venn 图分析 如图3 所示，在相似度为97% 的水平下，2 组共聚类得到2 306 个OUT，对照组和试验组分别为2 179 个和2 116 个，共用1 989 个OUT，占OUT 总数的86.25%，独有的OUT 数分别为190 个和127 个，分别占OUT 总数的8.23% 和5.51%，表明2组 OUT 组成具有一定的相似度，但也存在差异。

表4 Alpha 多样性分析结果

图3 OUT 水平下瘤胃微生物Venn 图

2.2.4 群落组成分析 经过物种分类学比较，样品共包含20 门，34 纲，63 目，93 科，235 属。

2.2.4.1 门水平 如图4 所示，在门水平分类上，占主导的为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、螺旋体门（Spirochaetae）和纤维杆菌门（Fibrobacteres）。此外，软壁菌门（Tenericutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和变形菌门（Proteobacteria）占比均高于1%。拟杆菌门在试验组中最大值为64.05%，高于在对照组中的最大值57.48%（P＞0.05）。厚壁菌门在试验组中最大值为32.29%，低于对照组中的最大值34.06%（P＞0.05）。纤维杆菌门与螺旋体门在对照组与试验组中的相对丰度最高值均在0 h。纤维杆菌门在试验组中的平均值（4.02%）高于对照组（3.40%）；螺旋体门在试验组中的平均值（5.08%）高于对照组（4.41%）（P＞0.05）。其余相对丰度低于0.1%的门类被聚集到一起（others＜0.1%）。

图4 瘤胃菌群门水平相对丰度

2.2.4.2 属水平 如图5 所示，优势菌属为普雷沃氏菌属_1（Prevotella_1）、理研菌科_RC9 菌属（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、未排位拟杆菌_BS11 菌属（norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group）、密螺旋体菌属_2（Treponema_2）和纤维杆菌属（Fibrobacter）等，其余相对丰度低于1%的门类被聚集到一起（others＜1%）。普雷沃氏菌属_1 在试验组中平均值（34.34%）高于对照组（33.52%）（P＞0.05）。理研菌科_RC9 菌属在试验组中平均值（12.03%）高于对照组（6.91%）（P＜0.05）。纤维杆菌属在对照组的平均值（4.14%）高于试验组（3.39%）（P＞0.05）。瘤胃球菌科_NK4A214 菌属（Ruminococcaceae_NK4A214_group）在对照组的平均值（3.14%）高于试验组（3.06%）（P＞0.05）。丁酸弧菌属_2（Butyrivibrio_2）在试验组的平均值（1.72%）高于对照组（1.20%）（P＞0.05）。丹毒进菌科_UCG-004 菌属（Erysipelotrichaceae_UCG-004）在试验组的平均值（1.47%）高于对照组（0.77%）（P＜0.05）。韦荣球菌科_UCG-001 菌属（Veillonellaceae_UCG-001）在试验组的平均值（0.65%）低于对照组（1.31%）（P＜0.05）。克里斯滕森菌属_R-7（Christe nsenellaceae_R-7_group）在试验组中的平均值（0.79%）低于对照组（1.12%）（P＜0.05）。

图5 瘤胃菌群属水平相对丰度

2.2.5 PLS-DA 分析 PLS-DA 分析作为样本分组分析中的一种，具有忽略组内的随机差异，突出组间系统差异的特点。各点之间的距离代表各个样本组成的相似性与差异性，其距离越近，样本的相似性越高；距离越远，样本的相似性越低。如图6 所示，2 个组内各点的距离接近，具有相似性，而两组间的距离偏远，具有一定的差异性。

图6 PLS-DA 分析结果图

3 讨 论

3.1 瘤胃液采样方法的分析 反刍动物瘤胃中微生物种群根据寄生的位置不同可分为固相瘤胃微生物、液相瘤胃微生物和贴附于瘤胃壁的微生物三类。在瘤胃液采集工作中，如单一抽取瘤胃液相微生物作为样本进行试验分析，固态内容物上黏附的大量细菌就可能没有被取样，样品出现偏差，整体数据的准确性会受到影响，因此，要根据微生物寄生的不同位置，采集不同瘤胃内容物混匀后才可作为样品[12-13]。本试验采用对瘤胃内容物残渣、食糜和瘤胃液结合，并用缓冲液清洗的方法，获得较高代表性的瘤胃菌群样品。

3.2 9 种瘤胃菌数量变化分析 反刍动物的瘤胃器官是一个高效的发酵系统，其独特优势在于可以降解植物源类纤维素。大量的微生物寄生于瘤胃中，参与消化和吸收纤维素类营养物质的过程。其中，黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌占据着主导地位。经过植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或酵母菌等微生物发酵处理的饲料饲喂反刍动物后，该3 种菌的数量均有极显著提高[14-16]。Hoang 等[17]试验表明，由枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母菌和乳酸菌组成的复合菌活性添加剂可提高机体对粗纤维等营养物质的消化率，进而提高饲料转化效率。本试验中，酵母发酵饲料增加了黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量，可提高机体对纤维素类营养物质的消化率。除了纤维素类分解菌之外，本研究中溶纤维丁酸弧菌、栖瘤胃普雷沃氏菌和埃氏巨球型菌的数量也在试验组中有所增加。溶纤维丁酸弧菌和栖瘤胃普雷沃氏菌具有淀粉降解酶活性和蛋白降解酶活性，可以降解蛋白质和淀粉等多糖类大分子的营养物质[18]。溶纤维丁酸弧菌还可参与体内的氢化作用，将不饱和脂肪酸转变成饱和脂肪酸，提高机体的增重效果[19]。酵母发酵饲料中富含甘露聚糖、葡聚糖和氨基酸，可诱导溶纤维丁酸弧菌和栖瘤胃普雷沃氏菌的大量增殖。在现代肉羊养殖业中，大比例使用精饲料以达到短时间增重的目的，使得瘤胃中牛链球菌快速增殖生长并产生乳酸，易造成肉羊瘤胃酸中毒的现象。以氨基酸为氮源的埃氏巨球型菌可代谢乳酸，该菌在防止乳酸性酸中毒、提高淀粉的利用率、参与氨基酸的脱氨脱羧反应以及形成挥发性支链脂肪酸的过程中都发挥重要的作用[20]。酵母发酵饲料提高了埃氏巨球型菌数量，可提高营养物质消化率，也可预防瘤胃酸中毒，维持瘤胃微生态环境的稳定。此外，酵母细胞壁的特殊空间结构可以吸附黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素。酵母细胞壁中的多糖类物质能竞争性地阻止病原菌在肠壁上的定植，可有效减少金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等病原菌数量，有利于瘤胃细菌的繁殖并改善瘤胃微生态环境[21-25]。微生物发酵饲料对牛链球菌影响的报道并不一致[8,26]，造成差异的原因可能与发酵底物、发酵菌种以及试验动物的品种有关。本文中酵母发酵饲料增加了牛链球菌数量。反刍兽甲烷短杆菌是瘤胃中最主要的产甲烷菌。苹果酸或延胡索酸等有机酸物质可通过氢代谢途径产生丙酸和共轭亚油酸，消耗氢离子来抑制甲烷的生成[27]。有研究表明饲粮中添加乳酸菌或活性干酵母可降低产甲烷短杆菌属的数量，降低了甲烷排放量约40%[28-29]。本研究中的酵母发酵饲料也可显著降低反刍兽甲烷短杆菌数量，减轻畜牧生产中甲烷对外界环境的污染。

3.3 16S rRNA 基因高通量测序结果的分析 诸多学者利用高通量测序技术发现，生物饲料可提高瘤胃菌群的多样性与丰度[30]。本研究结果与之相悖，可能与饲料的高消化率与高效的代谢途径相关。部分菌群因为具有高效简便的代谢通路，可在营养物质消化过程中占据主导地位，在短时间内积累大量的代谢产物。高效的微生物菌群并不会出现冗杂的结构层次，能快速地满足机体能量需求即可[31]。Bagheri[32]认为玄参提取物和莫能菌素可使菌群多样性降低。本研究中酵母发酵饲料降低了瘤胃微生物菌群的多样性，使瘤胃细菌更有效率地降解营养物质，这可能是其能够显著提高绵羊生长性能和免疫功能的原因[5]。在门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门是反刍动物瘤胃中的优势菌门[33]。其次，根据物种、日粮、年龄和生长环境等条件的不同，纤维杆菌门和密螺旋体门会出现不同的优势占比。拟杆菌门在非纤维物质的降解中发挥重要作用，而厚壁菌门、螺旋菌门和纤维杆菌门能够降解纤维素、半纤维素、果胶等，对植物类纤维物质转化为挥发性脂肪酸（VFA）产生重要影响[34]。有研究表明随着酵母培养物（Yeast Culture，YC）添加水平的升高，拟杆菌门相对丰度逐渐增加，厚壁菌门的相对丰度逐渐降低，螺旋菌门和纤维杆菌门的数量也会出现相应的变化，但不显著[34]。本试验结果也出现了类似的变化趋势。在属水平上，本试验中的普雷沃氏菌属_1 的相对丰度最高，与前人研究结果[35]一致。普雷沃氏菌属_1 在各组间的差异不显著，可能因为对照组与试验组的饲粮粗蛋白质和能量水平相近，没有对普雷沃氏菌属的相对丰度产生显著影响。研究发现理研菌科_RC9 菌属含量随着日粮纤维含量的降低，表达量降低[36]。理研菌科具有降解结构性碳水化合物的作用[37]，酵母发酵饲料可增加理研菌科含量以提高纤维素的降解。克里斯滕森菌属于厚壁菌门，在维持胃肠道结构、功能和动物机体免疫调节方面发挥重要作用[38]。有研究认为克里斯滕森菌的相对丰度随着YC 添加水平的升高而降低，且与瘤胃pH 和NH3-N 含量呈显著正相关，说明克里斯滕森菌属与VFA 和NH3-N 的代谢相关[34]。本课题组前期试验表明，酵母发酵饲料可增加瘤胃中VFA，降低NH3-N 的浓度[9,39]。所以克里斯滕森菌属_R-7 含量增加受到了酵母发酵饲料的正向影响，进而改善了瘤胃的微环境。

16S rRNA 高通量测序结果最低到属水平，需要结合实时荧光定量PCR 的结果细化到种水平。在qPCR检测中，隶属于拟杆菌门的溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、和隶属于纤维杆菌门的产琥珀酸丝状杆菌的变化趋势与高通量测序结果保持一致。高通量测序结果显示厚壁菌门在试验组中含量较低，而qPCR 检测中埃氏巨型球菌在对照组中含量较低，二者结果不一致。在属水平上，高通量测序结果中纤维杆菌属和瘤胃球菌属在对照组中的含量略高于试验组，与qPCR 检测中产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的结果不一致，可能原因为qPCR 引物的特异性较高，而高通量测序中使用的是通用引物。此外，反刍兽甲烷短杆菌属于古细菌中的广古菌门，不属于细菌。高通量测序中的细菌V3～V4 区通用引物未能涵盖检测，需要qPCR检测来补充说明。

近年来利用分子生物学方法研究反刍动物瘤胃调控和微生物菌群之间互作关系虽有些许成果，但还需全面地深入了解和揭示。有国外的学者应用计算硬件及配套的控制理论，设计了高性能微生物群落数据分析方法GPU-Meta-Storms，可实现在微秒的时间内对微生物群落的环境样本元基因组数据进行比较，未来可能应用于监控瘤胃微生物的实时动态变化。另外，随着完整基因组序列数据库不断扩大，再加上环境特征数据的补充完善，可进一步评估酵母发酵饲料对瘤胃微生物多样性及其功能的影响[40]。

4 结 论

本研究结果表明，酵母发酵饲料可促进纤维降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌、乳酸利用菌的生长繁殖，降低产甲烷菌的数量和瘤胃细菌的多样性，改善瘤胃菌群结构。