不同运动方式和运动时间对小鼠睾酮分泌和精子生成的影响

张 姹 ，魏易焓，卢静怡，王蕾蕾，常成杰，徐 畅，袁业现，尹 聪，束 刚*，江青艳

（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；2.广东省动物营养调控重点实验室，广东广州 510642）

雄性动物的精子数量和活力是保证雌性动物受胎率、产仔数和子代健康的重要前提[1]。在雄性生殖系统中，睾丸和附睾是重要的性腺器官[2]。睾丸主要由睾丸曲细精管和管外组织组成，曲细精管是精子生成的场所[3]。睾丸生成的精细胞不具备运动与受精的能力，需要在附睾中完成精子成熟相应的形态变化和功能变化[4]。雄激素是维持性腺功能必不可少的激素[5]。

除性腺激素外，雄性动物生殖能力还受到营养、应激和运动等多种因素影响[6]。其中，运动是改善动物生殖机能的有效方式之一。在畜牧生产中，通常需要给种公猪配备运动场，满足运动的需求，以保证精液品质[7-8]。目前研究运动对生殖能力影响的研究模型多为肥胖且生殖能力受损的小鼠[9]。有研究表明，高脂诱导肥胖大鼠长期负重游泳训练可显著增加大鼠的精子总数、增加精子活动率[10]。相反，间接性耐力会显著增加肥胖大鼠的精子畸形率，降低精子总量[11]。可见不同的运动方式和运动强度对小鼠生殖机能的影响不一，但目前鲜有关于运动对健康青年小鼠生殖能力影响的报道。因此，本实验主要研究力竭运动（Exhaustive Exercise，EE）、短期有氧运动（Acute Aerobic Exercise，AAE）和长期有氧运动（Chronic Aerobic Exercise，CAE）对健康青年雄性小鼠睾酮分泌和生殖的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 不同运动模型小鼠的构建 实验所用雄性的C57BL/6J 小鼠均购自广东省实验动物中心（广东佛山）。32 只11 周龄雄性小鼠按体重随机分成4 组（n=8），分别是对照组（CON 组）、力竭运动组（EE 组）、短期有氧运动组（AAE 组）和长期有氧运动组（CAE 组）。EE组训练方法：在跑步机上以10 m/min 的速度跑10 min后休息10 min，休息结束以10 m/min 的速度每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 持续训练3 h，训练结束后迅速采样。AAE 组训练方法：在跑步机上以10 m/min 的速度跑10 min 后休息10 min，休息结束在10 m/min 的速度基础上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持续训练1 h，训练结束后迅速采样。CAE 组训练方法：在跑步机上以10 m/min的速度跑10 min 后休息10 min，休息结束后在10 m/min的速度基础上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持续训练1 h，每天按照上述方式重复训练，每训练5 d 休息2 d，训练2 周后停止训练，最后一次训练结束后24 h 内采样[12]。

1.2 性腺样本的采集、HE 染色及统计方法 实验结束后小鼠脱颈法处死，腹部涂抹75% 酒精，开腹后迅速采集一侧完整睾丸和附睾置于4%的多聚甲醛中固定过夜，然后经过乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。HE 染色过程：经二甲苯脱蜡，乙醇溶液脱水，苏木精伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

使用ImageJ 1.8.0 统计睾丸曲细精管空腔绝对面积。附睾尾每个样品随机选取10 个视野，统计该视野不规则附睾管的比率，最后求均值。小鼠处死后迅速分离附睾，转移至1 mL、37℃生理盐水中，剪刀剪碎附睾，37℃孵育10 min 后，移液枪轻轻吹匀精子悬浮液后，用血球计数板测定精子数量；将悬浮液均匀抹于玻片上风干，甲醇固定5 min，伊红染色1 h，蒸馏水浸洗。风干后在400 倍光学显微镜模式下观察2000 个精子细胞的形态，统计精子畸形率。

1.3 血清样品检测 采集小鼠全血，4℃、3000 r/min离心25 min，吸取上层血清-20℃保存备用。血清睾酮水平的检测：采用Testosterone assey kit（USA，R&D system）检测。

1.4 睾丸样本的采集及荧光定量PCR 检测 小鼠处死后分别取出取完整睾丸置于液氮中速冻，然后将样品转移至冰箱中-80℃保存。提取睾丸组织总RNA，利用试剂 TRIzol，常规方法抽提，荧光定量PCR 检测睾丸中睾酮合成代谢转运相关基因包括类固醇急性转运蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，STAR）、3β-羟基类固醇脱氢酶异构酶2（Hydroxy-Delta-5-Steroid Dehydrogenase,3 Beta-And Steroid，3β-HSD）、17β羟类固醇脱氢酶（Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase，17β-HSD）、类固醇5α-还原酶1（Steroid 5 Alpha-Reductase 1，SRD5A1）、类固醇5α-还原酶2（Steroid 5 Alpha-Reductase 2，SRD5A2）和细胞色素P450 胆固醇侧链裂解酶（Cytochrome P450scc，P450scc）。以β-actin作为内参，对获得的数据进行处理。基于各目的基因与内参基因的扩增效率接近，根据公式计算目的基因相对于内参基因的比值来反映各基因的相对表达丰度：2-△△Ct=2-（Ct 目的基因-Ct 内参基因），其中Ct目的基因为目的基因的Ct 值，Ct内参基因为内参基因的Ct 值。

表1 荧光定量PCR 所用引物序列

1.5 统计分析 实验结果用平均值±标准误表示，采用GraphPad Prism 8.0.2 软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05 表示显著差异。

2 结果

2.1 不同运动方式对雄性小鼠性腺重量及血清睾酮水平对比不同运动方式的结果发现，EE 可显著增加小鼠睾丸组织重量，AAE 和CAE 对小鼠睾丸和附睾的组织重量均无显著影响（图1-A），组织重量按照小鼠体重校正。与对照组相比，EE 可显著降低小鼠血清睾酮水平，AAE 对小鼠血清睾酮无显著影响，而CAE 可显著上调小鼠血清睾酮（图1-B）。可见不同运动方式可能通过影响睾酮分泌水平，调节雄性生殖能力。

2.2 不同运动方式对血清睾酮代谢相关基因表达的影响 图2 表明，EE 可降低STAR mRNA 的表达，AAE 对STAR 表达无显著影响，而CAE 可上调STAR表达（P＜0.05）。不同运动训练对睾丸3β-HSD、17β-HSD、SRD5A1、SRD5A2 的mRNA 表达均无显著影响。由此提示，不同运动方式可能通过调控睾丸STAR mRNA 表达，从而影响血清睾酮水平。

图1 不同运动方式对雄性小鼠性腺重量和血清睾酮的影响（n=8）

图2 不同运动方式对小鼠血清睾酮及睾丸睾酮合成代谢相关基因表达的影响（n=8）

2.3 不同运动方式对睾丸曲细精管结构的影响 如图3所示，对照组、AAE 组和CAE 组睾丸组织曲细精管排列紧密，睾丸间质无渗出；但EE 组曲细精管排列不紧密，间质可见细胞渗出；而CAE 组曲细精管空腔面积显著低于其他3 组，说明精子生成较多。

2.4 不同运动方式对雄性小鼠附睾发育的影响 如图4所示，EE 组小鼠附睾管排列不紧密，附睾管形状不规则，间质可见渗出的精子。AAE 和CAE 组小鼠附睾管排列紧密，附睾管形状规则，与对照组无明显差异。提示EE 可损害附睾管管壁结构。

图3 不同运动方式对小鼠睾丸曲细精管结构的影响（n=8）

2.5 不同运动方式对雄性小鼠精子品质的影响 进一步通过小鼠精子涂片HE 染色，发现EE 组精子总数虽无变化，但其畸形率显著升高；相反，CAE 可显著增加精子总数，显著降低精子畸形率（图5）。AAE 对小鼠精子总数和精子畸形率均无显著影响。

图4 不同运动方式对雄性小鼠附睾发育的影响（n=8）

图5 不同运动方式对雄性小鼠精子品质的影响（n=8）

3 讨 论

运动可以调节雄性动物生殖能力，也可以调控雄性动物血清睾酮水平。有研究表明，运动可显著增加公猪性腺器官指数，显著提高每次射精的精子总数[13]。长期中等强度游泳可有效激活肥胖小鼠瘦素信号通路，增加其血清睾酮水平，但长期高强度游泳反而抑制该信号通路，降低血清睾酮水平，降低精子质量[14]。这些研究中运动对于雄性动物生殖或睾酮水平的影响并不一致，原因可能与运动的时间和强度有关。本研究也发现，仅一次性力竭运动可显著降低小鼠血清睾酮水平，损伤精子品质，而CAE 则可显著提高小鼠血清睾酮水平，提高精子品质。目前对于高强度运动损伤雄性生殖系统的机制还不是非常清楚，推测可能与应激激素、代谢物和局部炎症水平有关。有研究发现，高强度运动可以增加肥胖小鼠的皮质酮和乳酸的产生，从而降低睾酮的分泌，而中低强度的运动会抑制NF-κB 信号通路的激活，减少TNF-α转录表达，改善精子质量，提高雄性生殖能力[15]。上述结果说明，长期有氧运动对雄性动物生殖机能最为有利。所以在畜牧生产中可考虑采用长期有氧运动来改善种公猪繁殖性能。

雄性动物精子发育、成熟和品质不仅受到性腺局部组织的微环境，如睾丸组织局部炎症、附睾液pH 等影响，也受性激素、甲状腺素等内分泌激素影响[16]。其中，下丘脑-垂体-性腺轴对于精子发生和精子成熟过程是不可或缺的。摘除成年雄性大鼠垂体，大鼠精子发生过程受损，如补充睾酮可重新启动精子发生过程，而且促黄体素（Luteinizing Hormone，LH）、促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）以及睾酮的协同作用对维持正常生精和生精再激活必不可少[17]。本研究发现，不同的运动方式和运动时间对于小鼠睾酮水平有不同的影响。其中，EE 可显著降低血清睾酮水平，而CAE 可显著提高小鼠睾酮水平。睾酮水平受多种代谢酶影响，睾酮的生成涉及多种转运蛋白和酶促反应，其中STAR和P450scc分别是睾酮合成过程中重要的运载体和主要的限速酶[16]。STAR转运胆固醇至线粒体内膜，在线粒体内膜上的P450scc催化胆固醇裂解成为孕烯醇酮，后者由3β-HSD转运至滑面内质网，经17β-HSD催化生成睾酮[18]。有研究报道，6 周间歇性游泳训练可显著降低大鼠睾丸STAR的mRNA 水平[19]。本研究检测不同运动后小鼠睾丸睾酮合成代谢转运酶相关基因发现，EE 可显著抑制睾丸STARmRNA 表达，抑制胆固醇转运至线粒体内膜，而CAE 可显著上调睾丸STARmRNA 表达，增加胆固醇的转运。由此可以推测，STAR可能是运动调节睾酮合成的关键靶点，而运动对睾酮合成代谢酶酶活是否有影响还需进一步研究。

睾丸生成的精子需要在附睾中完成精子成熟相应的形态变化和功能变化，包括原生质滴移位、顶体形状和大小的变化、精子头尾结构的固定等[19]。由此可知，附睾组织受损可导致精子畸形率的异常增加[20]。目前尚无运动如何直接通过调控附睾功能，从而影响精子成熟的研究报道。有研究表明，6 周有氧运动可增加高糖诱导肥胖小鼠附睾脱氢表雄酮的水平，同时改善大鼠的生殖功能[21]。脱氢表雄酮是作为睾酮来源的前体物质，但尚不清楚脱氢表雄酮是否介导了运动对附睾功能的调控。本研究发现，EE 严重损害小鼠附睾管管壁形态，精子渗出至间质，降低睾酮水平，导致精子畸形率显著增加；而CAE 组虽对附睾形态无明显影响，但可以显著升高睾酮水平，同时降低了精子的畸形率。不同运动方式和运动时间通过何种机制影响附睾功能和精子成熟还有待于进一步深入研究。

4 结 论

本实验发现，长期有氧运动可显著促进睾酮分泌和精子生成，同时降低精子畸形率，但急性力竭运动正好相反。短期有氧运动对雄性生殖无显著影响。