柚皮苷联合骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质对软骨损伤的修复作用及机制

叶 超,王庆甫，陈 婧,杨 正，曲 弋，王建军，王逢贤，潘 渝，李鹏洋

(1. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；3. 北京中医药大学中医学院，北京 100029)

关节软骨的损伤退变是骨性关节炎的主要特点之一，膝骨性关节炎是骨性关节炎中常见的类型之一[1]，膝骨性关节炎疾病进展的核心是膝关节软骨组织损伤退变程度的加重。软骨组织由软骨细胞和细胞外基质共同构成，转化生长因子-β(TGF-β)家族内有多种生长因子，具有刺激软骨细胞增殖、细胞外基质生成的重要作用[2]。间充质干细胞来源于中胚层，属于多能干细胞，具有向软骨细胞分化的能力。骨髓间充质干细胞是取自骨髓的间充质干细胞，具有低免疫原性、对机体损伤小等诸多特点，在软骨损伤退变的修复过程中得到了广泛的应用和深入的研究。以间充质干细胞为中心的组织工程技术，为关节软骨损伤退变治疗带来了新的理念[3]。中药骨碎补具有补肾强骨作用，广泛用于膝骨性关节炎的治疗；柚皮苷是骨碎补的有效成分之一[4]，其具有保护白细胞介素-1β(IL-1β)诱导退变关节软骨细胞，促进软骨细胞增殖的作用[5]。课题组前期研究发现，柚皮苷灌胃配合骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质，不仅能促进软骨的修复，同时可以提高修复质量[6]。但上述的修复作用是否通过TGF-β因子刺激实现的尚不得而知，因此设计了本实验，在关注修复质量的相关指标基础上，着重观察在修复过程中TGF-β2、TGF-β3在修复处的分泌情况，探讨柚皮苷对于关节软骨缺损修复可能的机制，为治疗膝骨性关节炎提供有效途径和应用依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性清洁级新西兰大耳白兔12只，2～3个月，体质量约2.5 kg，北京市昌扬西山养殖场提供，合格证号：SCXL(京)2011-0010。饲养环境：室温15～25 ℃，湿度45%～60%，明暗各12 h；实验中对动物的处置方法符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求及2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.2实验药物及试剂 柚皮苷汤配置方法：柚皮苷由上海金穗生物科技有限公司提供，灌胃浓度(柚皮苷质量计算)为0.008 4 g/kg。脱细胞真皮基质：北京积水潭医院骨库提供。

1.3实验主要试剂 胎牛血清(Gibco)；青链霉素混合液(Solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液0.25%(Solarbio)；DMEM(Solarbio)；PBS磷酸盐缓冲液(Solarbio)；苏木精-伊红染色 (Solarbio)；甲苯胺蓝染色(Solarbio)；番红-O染色(Solarbio)；TGF-β2染色(Bioss)；TGF-β3染色(Bioss)；X型胶原染色(Bioss)。

1.4方法

1.4.1动物造模及骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质制备 动物造模：按课题组前期研究基础进行手术[6]。麻醉后，应用角膜环钻在股骨髁滑车关节面钻孔，深达软骨下骨。骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质制备：按课题组前期发表课题研究成果的方案[6]，将第3代兔骨髓间充质干细胞种植在脱细胞真皮基质上。

1.4.2动物分组及干预方法 将12只新西兰大耳白兔适应性喂养1周，随机分为3组，每组4只8个膝关节。模型组造模后给予去离子水灌胃；细胞组造模后在关节缺损处植入骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质，给予去离子水灌胃；柚皮苷联合细胞组造模后在关节缺损处植入骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质，给予柚皮苷汤灌胃。均连续灌胃12周，实验过程中白兔均存活。

1.4.3标本制作方法 各组白兔于灌胃12周结束后麻醉处死，解剖膝关节，大体观察膝关节软骨缺损处的变化，并进行取材和制备标本。

1.5观测指标

1.5.1关节软骨O’Driscoll评分 结合病理染色情况，观察细胞形态、关节面缺陷修复程度、修复边缘情况、宏观外观表面修复程度、细胞退行性病变程度，按O’Driscoll 评分系统评分，分值越高说明软骨缺损修复越满意。

1.5.2关节软骨Mankin’s评分 结合病理染色情况，对软骨结构、软骨细胞、蛋白多糖含量以及潮线完整性，按Mankin’s评分系统评分，评分越高说明软骨缺损越严重。

1.5.3关节软骨病理学染色 将关节软骨缺损区域行病理学染色，包括苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红-O染色。

1.5.4关节软骨免疫组化染色 将关节软骨缺损区域行免疫组化染色，包括TGF-β2染色、TGF-β3染色、X型胶原染色。

2 结 果

2.13组关节软骨O’Driscoll 评分和Mankin’s 评分比较 细胞组和柚皮苷联合细胞组O’Driscoll 评分均明显高于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷联合细胞组明显高于细胞组(P<0.05)；细胞组和柚皮苷联合细胞组Mankin’s 评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷联合细胞组明显低于细胞组(P<0.05)。见表1。

2.23组关节软骨病理学染色 苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色显示，细胞组和柚皮苷联合细胞组可见新生软骨细胞排列较整齐，呈扁椭圆形，柚皮苷联合细胞组软骨细胞呈强嗜碱性染色，软骨下骨染色均匀，新生效果更佳；模型组未见明显缺损修复，缺损处以纤维组织为主。番红-O染色显示，柚皮苷联合细胞组软骨基质呈比较均匀的红色，细胞组也可见修复的少量红色，但模型组未见明显红染。见图1。

表1 3组白兔关节软骨O’Driscoll 评分和Mankin’s评分比较分)

2.33组关节软骨免疫组化染色 染色显示，细胞组在关节缺损修复处稍有TGF-β2、TGF-β3分泌；柚皮苷联合细胞组出现明显分泌的TGF-β2、TGF-β3，存在很少量的X型胶原染色。见图2。

3 讨 论

关节软骨属于透明软骨，具有缓冲外力及减少震荡的作用，其覆盖在关节表面，在膝关节运动时可以减少关节内的摩擦阻力。由于组织血液供应的原因，关节软骨损伤后的自身修复能力极差，导致关节疼痛等症状。

组织工程学是将生命科学和工程学原理相结合的交叉学科，为关节软缺损修复提供了新的途径。间充质干细胞增殖能力强，具有多向分化能力，可以分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等多种组织。骨髓间充质干细胞存在骨髓中，其在成软骨方向的分化能力在骨组织工程方面具有独特的优势。本研究应用全髓贴壁法进行细胞的分离和纯化。该方法是Firedenstein首先进行报道使用[7]，其优点为：在操作的过程中可以保留其生长的微环境，对于细胞的刺激很小，在完成后细胞能很快地进行正常增殖，更好地为研究提供充足可靠的细胞来源。本研究所使用的脱细胞真皮具有良好的柔韧性，孔隙均匀，组织相容性好，适于细胞黏附及长期生长[8]。

本研究结果显示，柚皮苷联合细胞组骨缺陷处可以见到明显修复平整的关节面，与周围组织边界关系出现融合表现，与周边软骨的界限比较模糊，但较之细胞组出现了较光滑的修复；细胞组修复表面少量不规则，软骨细胞有细胞团的出现，柚皮苷联合细胞组软骨细胞弥漫性增多；模型组缺损处未见明显组织填充，与周围有明显的界限，同时蛋白多糖含量明显减少，细胞组和柚皮苷联合细胞组均可见再次分泌的蛋白多糖。说明从修复结构的角度来看，柚皮苷联合细胞组可以得到满意的效果，细胞组次之。

苏木精-伊红染色适用于观察组织形态结构和软骨细胞的形态变化。番红-O染色与硫酸软骨素和硫酸角质素结合，可以观察到蛋白聚糖的分布和含量。甲苯胺蓝是一种吩噻嗪类易染性阳离子染料，该染色技术可以观察到酸性黏多糖。本研究中，上述3种染色方法显示柚皮苷联合细胞组软骨细胞和细胞外基质修复情况均优于细胞组和模型组，说明从修复质量的角度来看，柚皮苷联合细胞组效果满意。

TGF-β超家族信号在间充质细胞迁移、聚集以及向软骨细胞分化，形成软骨原基的这个过程中，主要通过Smad 蛋白依赖途径进入细胞核发挥功能[9]。值得关注的是，间充质干细胞表面具有TGF-β的受体。软骨细胞形成后，TGF-β信号通路有助于维持软骨细胞内稳态[10]，在膝关节软骨损伤修复的过程中有重要的作用，影响着膝骨性关节炎的进程。哺乳动物中TGF-β主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33个亚型[11]。TGF-β2参与多种细胞的生长、分化过程，可诱导间充质细胞转化为软骨细胞，可促进软骨细胞增殖，调节软骨细胞的分化和胞外基质的合成[12]，其促进软骨形成的作用可能是通过促使SMAD2 磷酸化实现的[13]；而且其还有维持软骨细胞形态，促进其增殖及Ⅱ型胶原分泌的作用[14]。TGF-β3可促进软骨细胞增殖,调节软骨细胞分化,增强细胞外基质的合成，其比TGF-β1诱导软骨分化的作用更强[15]，可以提前从表达的Ⅰ型胶原变为表达Ⅱ型胶原[16]。有研究表明TGF-β3在骨关节炎软骨中表达下调[17]。本研究免疫组化染色发现，柚皮苷联合细胞组中可见明显分泌的TGF-β2、TGF-β3，说明柚皮苷可刺激骨髓间充质干细胞软骨方向分化，刺激TGF-β2、TGF-β3分泌。

X型胶原是一种短链、网状形成胶原，是肥大软骨细胞的特异性表型[18]，会使软骨细胞失去性能，进一步分化导致肥大的软骨细胞钙化，影响关节软骨的结构和强度[19]，其通常合成并沉积于活跃生长板的肥厚带。近期研究发现与肥大软骨细胞相关的X型胶原可作为诊断膝骨性关节炎的生化标志物[20]。另有研究表明，Ⅹ型胶原表达增加，可使得骨关节炎的进展加快[21]。本研究免疫组化染色发现，柚皮苷联合细胞组仅见少量X型胶原表达，明显少于细胞组和模型组，说明柚皮苷可以减缓软骨退变。

柚皮苷是中药骨碎补的有效成分之一，具有化学结构明确、分子量小等特点。课题组前期研究发现口服中药柚皮苷汤能促进兔膝关节软骨缺损的修复[22]。周荣魁等[23]研究表明中药骨碎补总黄酮可以通过抑制兔膝软骨MMP-1、MMP-3 及TIMP-1，从而起到防治骨关节炎作用。本研究结果提示，骨髓间充质干细胞结合脱细胞真皮基质具有修复膝关节软骨损伤的作用，加用柚皮苷后，修复效果更好。该修复效果的获得，可能与柚皮苷加速骨髓间充质干细胞软骨方向分化及刺激TGF-β2、TGF-β3分泌有关，这也从微观层面证实中药产生作用具有物质学基础。但膝关节软骨损伤的修复过程中可能涉及其他信号通路相关因子的共同作用，柚皮苷对于其他信号因子是否存在同样的刺激作用有待研究确定。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。