芍甘附子汤加味对CIA大鼠关节滑膜病理及血清IL-2、IL-17A与TNF-α表达水平的影响*

张玉婷，侯秀娟，刘小平，朱跃兰

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院风湿科，北京 100078）

类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性、全身性自身免疫性疾病，以对称性、多关节炎为主要特点。RA病程长且常常反复发作，具有发病率高和致残率高的特点，严重危害患者的身心健康，影响患者的生活质量。RA的发病机制复杂，病因尚未完全阐明，多种促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-17、IL-6、IL-1、IL-21及 IL-22等在RA的发病过程中起重要作用[1]。辅助性T细胞17（Th17）以及IL-17在RA发病中的重要作用越来越受重视[2-4]。其中，IL-17A通过相关信号转导通路，可从多个方面加重RA关节处炎症程度和关节损害[5]。此外，临床上针对TNF-α、IL-1及IL-6的靶向药物应用较广泛，此类生物制剂具有起效快、抑制骨破坏明显等特点。本病属于中医“痹证”范畴，中医药干预RA具有不良反应小、依从性好等特点。本实验通过建立胶原诱导性关节炎（CIA）模型，探讨芍甘附子汤加味对CIA大鼠模型关节病理改变及血清炎性细胞因子IL-2、IL-17A及TNF-α的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雌性Wistar大鼠24只，体质量（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，适应性喂养1周。

牛Ⅱ型胶原（CⅡ，批号：20022）购自美国Chondrex公司；不完全弗氏佐剂（IFA，批号：7002）购自美国Sigma公司；IL-2酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒、IL-17A ELISA检测试剂盒及TNF-α ELISA检测试剂盒均购自北京欧北生物科技有限公司；切片机（德国 Leica）；摊片机（德国 Leica）；包埋机（德国Leica）；自动脱水机（德国Leica）；倒置显微镜（Olymp）。

芍甘附子汤加味，方药组成：制附子15 g，白芍15 g，甘草 10 g，鸡血藤 15 g，青风藤 15 g（以上药物由北京中医药大学东方医院药剂科统一采购，实验过程中保证所用药品为同一批次，并由北京中医药大学中药学院中药鉴定教研室鉴定质量控制），用前全部药材经煎煮（制附子先煎30 min）并过滤，水浴蒸发至其治疗剂量每1 mL药液含生药材1.42 g。雷公藤多苷片：10 mg×100片/盒，购自湖南千金协力药业有限公司，批准文号：Z43020138，用前蒸馏水配制为1 mg/mL。

1.2 造模及分组 将24只大鼠随机分出6只作为正常组，其余18只均建立CIA模型，造模成功后再随机分为模型组、雷公藤组、芍甘附子汤组，每组6只大鼠。造模方法：CⅡ溶于乙酸，与等体积IFA溶液混合，制备CⅡ终浓度2 mg/mL混合液，于大鼠左足底皮下按0.1 mL/足注射，尾根部多点注射0.1 mL/只，防止局部坏死。初次免疫后第8天尾根部注射抗原（0.1 mL/只）加强免疫1次。正常组大鼠左足皮下注射等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.3 干预方法 正常组：常规饲养，自由饮水，不做任何处理；模型组：蒸馏水2 mL（/kg·d）灌胃；雷公藤组：雷公藤多苷片6.25 mg（/kg·d）灌胃；芍甘附子汤组：芍甘附子汤加味12.5 g（/kg·d）灌胃（依据人与动物体表面积换算的等效剂量）。各给药组均在造模成功后开始灌胃给药。

1.4 苏木精-伊红（HE）染色 灌胃结束后处死大鼠，取后右足踝关节去除皮肤和肌肉，10%中性甲醛溶液固定24 h，12.5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）室温中脱钙，2 d换1次脱钙液，30 d关节基本软化后切片，HE染色，干燥并封片，显微镜下观察脱钙后关节滑膜组织病理变化。

1.5 标本采集及检测 灌胃结束后，大鼠麻醉并腹主动脉取血，先以普通采血管取2 mL，室温静置1 h后，以3 000 r/min离心15 min，离心半径为60 mm，分离血清，分装于1.5 mL离心管中。ELISA法检测大鼠血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法 数据用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果及分析

2.1 HE染色 正常组踝关节组织结构正常，关节软骨表面光滑，未见滑膜组织增生及炎性细胞浸润。模型组关节腔明显狭窄，滑膜组织重度增生，局部坏死脱落，血管翳形成，关节软骨破坏明显。雷公藤组关节腔局部略狭窄，关节面大部分光滑，局部软骨脱落，滑膜组织轻微增生。芍甘附子汤组关节腔未见明显狭窄，关节软骨表面光滑，局部滑膜组织轻微增生。见图1。

图1 踝关节整体观（×100）

正常组滑膜细胞1～2层，未见滑膜细胞增生及炎细胞浸润。模型组滑膜组织明显增厚，局部坏死脱落，大量滑膜细胞增生及炎性细胞浸润。雷公藤组可见局部滑膜组织胶原纤维增生，未见明显炎性细胞浸润，关节面局部血管翳侵入。芍甘附子汤组可见局部滑膜组织增生，未见明显炎性细胞浸润。见图2。

2.2 血清IL-2、IL-17A及TNF-α水平 与正常组比较，模型组IL-2水平增高（P＜0.01），与模型组比较，雷公藤组及芍甘附子汤组IL-2水平下降（P＜0.01），芍甘附子汤组与雷公藤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组IL-17A水平较正常组增加（P＜0.01），与模型组比较，雷公藤组及芍甘附子汤组IL-17A水平下降（P＜0.01），芍甘附子汤组与雷公藤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，模型组TNF-α水平增高（P＜0.05），与模型组比较，雷公藤组TNF-α水平有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），芍甘附子汤组含量下降（P＜0.01），芍甘附子汤组与雷公藤组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

表1 各组大鼠血清IL-2、IL-17A及 TNF-α 水平（±s） ng/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与雷公藤组比较，△P＜0.01。

组别 动物数 IL-2 IL-17A TNF-α正常组 6 6.922±1.744 0.068±0.002 0.989±0.007模型组 6 9.478±2.195**0.081±0.010**1.054±0.044*雷公藤组 6 4.144±0.772# 0.063±0.008# 1.012±0.046芍甘附子汤组 6 4.867±0.869# 0.058±0.008# 0.917±0.014#△

3 讨论

RA属于自身免疫性疾病，其病理表现为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成，并出现关节的软骨和骨破坏，最终可导致关节畸形和功能丧失。RA的发病机制尚不完全清楚，实验动物模型仍是RA疾病研究的重要载体[6]。CIA模型在临床症状、病理学改变、免疫反应等方面都与人类RA特征高度相似，故CIA模型仍是目前公认的最佳RA动物模型[7]，被广泛用于研究疾病发病机制和验证治疗靶点[8]。

多种细胞因子均与RA发病密切相关[9]，其中，TNF-α在活动性RA中参与多种致病机制，导致滑膜组织的炎症增生、骨和软骨的破坏、自身免疫反应和RA并发症等病理生理过程[10]。Hassan等[11]研究发现RA患者的滑液中存在高浓度的TNF-α，且与骨侵蚀有关。IL-17A是IL-17家族重要成员之一，近年来多项研究发现它在RA的发病与进展中发挥作用[12-13]。IL-2由辅助性T细胞1（Th1）分泌，是激活T细胞、维持T细胞分化和增殖的重要细胞因子，可加重炎症反应。有研究发现RA患者血清IL-2水平明显高于对照组，且血清IL-2水平与血浆红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）水平及28处关节疾病活动度（DAS28）评分呈正相关，与RA疾病活动度密切相关[14]。本研究发现，模型组中TNF-α水平升高明显且HE染色中关节软骨破坏明显，血管翳形成，进一步证实了TNF-α参与RA滑膜炎症形成及对关节软骨侵蚀的过程，而芍甘附子汤组中TNF-α水平显著下降，且与雷公藤组相比具有统计学差异（P＜0.01），HE染色结果可见雷公藤组关节腔局部略狭窄，局部关节软骨脱落，而芍甘附子汤组关节腔未见明显狭窄，关节软骨表面平滑，未见关节软骨脱落。由此可见，芍甘附子汤加味在降低TNF-α水平和抑制关节软骨破坏方面优于雷公藤组。在RA的发生和发展过程中T淋巴细胞起着关键的作用。CD4+/CD8+比值的变化是RA发病及免疫损伤的核心环节，模型组IL-2、IL-17A水平与正常组相比均明显升高（P＜0.01），与RA的活动呈正相关，提示炎性因子表达升高导致T细胞亚群CD4+/CD8+之间相互抑制的平衡被打破，致使大鼠的细胞免疫功能降低，关节滑膜中淋巴细胞浸润而发病。本研究发现，芍甘附子汤组可降低IL-2、IL-17A及TNF-α水平，提示芍甘附子汤加味可有效改善关节及滑膜炎症，并对抑制CIA大鼠关节软骨破坏有一定的作用。

芍甘附子汤加味是在张仲景《伤寒论》芍甘附子汤的基础上加入鸡血藤、青风藤，常常用于痹证的治疗。本课题组前期临床研究结果显示，芍甘附子汤加味可改善RA患者关节肿痛、晨僵等症状，与西药联用，可降低血沉水平。现代药理学亦证实，本方中单个药物具有调节免疫、抑制炎症及抑制滑膜细胞增殖等作用[15-16]。方中附子辛、热，归心、肾、脾经，可补火助阳，通脉散寒止痛；白芍酸苦微寒，归肝、脾经，擅养血敛阴，柔肝止痛，为治疗四肢拘挛作痛的常用药之一；甘草，《注解伤寒论》认为其“益虚补血气而复脉”，味甘性平，归心、肺、脾、胃经，可补中坚筋骨，缓急止痛；附子、甘草相配辛甘化阳，白芍、甘草相伍酸甘化阴，在此基础上加用鸡血藤、青风藤以行血补血、舒筋活络、祛风湿，与附子配伍以达温阳通络之效。5药相合，邪正兼顾，标本同治，共奏扶助正气、调和阴阳、除湿散寒、化瘀通络之功。雷公藤多苷片为治疗RA的二线常用药物之一，其治疗RA疗效显著。研究表明，雷公藤多苷片治疗RA发挥抗炎作用与降低血中前列腺素E2（PGE2）、TNF-α和IL-2等因子的产生和释放有关[17]。本实验所使用的中药方剂为复方，各药物之间通过君臣佐使配伍发挥协同作用，可作用于多个靶点发挥抑制滑膜炎症和保护关节软骨的作用。本研究选择雷公藤多苷片作为阳性对照药，初步探究其与本方药在治疗RA效果的差异，芍甘附子汤组中TNF-α水平显著下降，且与雷公藤组相比差异具有统计学意义（P＜0.01），提示芍甘附子汤加味在降低TNF-α水平方面优于雷公藤组。

综上所述，芍甘附子汤加味可改善CIA大鼠关节滑膜炎症，保护关节软骨，降低血清IL-2、IL-17A及TNF-α表达水平，本研究结果为芍甘附子汤加味干预RA提供一定的实验依据。同时，本研究亦存在一定不足，如芍甘附子汤组和雷公藤组相比，IL-2和IL-17A水平差异无统计学意义，将增加芍甘附子汤高、中、低剂量组，进一步分析两组之间的差异及降低炎性细胞水平与剂量依赖的相关性，并开展细胞实验研究，进一步丰富本方药治疗RA的生物学依据。