马铃薯晋薯16 号愈伤组织再生体系的建立

牛瑜琦 孙 蕾 梅 超 王慧杰 宋倩娜 冯瑞云

（1 山西大学生物工程学院，太原 030006；2 山西农业大学农学院，太原 030031）

山西是我国马铃薯的主产区之一，种植区域主要分布在山西北部、西北部的丘陵和山地，商品薯产量高，品质优良。由于种植地区多为贫困地区，在精准扶贫力度持续增加的背景下，贫困适种地区的马铃薯种植面积呈增加态势，马铃薯产业已逐步成为当地红色支柱产业[1-2]。近年来，随着人民生活水平提高，对马铃薯品质的要求也相应提高，科技人员在马铃薯的品质、产量、抗病性及分子育种方面均取得较大进展[3]。

晋薯16 号是山西省农业科学院高寒区作物研究所在2006 年审定的马铃薯品种，产量高达2088kg/667m2，抗病性强，在山西北部、内蒙古乌蒙、河北张家口地区推广种植，2009-2011 年累计种植4 万hm2，推广前景良好[4-6]。在推广过程中，发现晋薯16 号中抗PVX 和PVY，重感B5-1 晚疫病生理小种，为避免产量降低、抗性退化等问题产生，需对品种进一步改良，筛选并导入具有相关抗性如抗PVX、PVY 病毒基因、抗晚疫病基因等优良基因，打破种间隔离的限制，提高品种抗生物与非生物胁迫的能力，改良品种农艺性状[7-8]。朱英等[9]研究表明，高效、稳定的遗传转化系统是转基因马铃薯育种获得突变植株的前提。虽然针对马铃薯遗传转化研究起步较早，但由于不同品种基因型的差异[10-11]，遗传转化体系也不尽相同，因此需要建立适合晋薯16 号的遗传转化愈伤组织再生体系。

本研究通过对马铃薯外植体选择、外植体表面消毒试剂浓度选择、根的诱导条件、最佳愈伤组织诱导和分化的植物激素组合及浓度进行研究，初步建立了马铃薯晋薯16 号再生体系，以期为马铃薯遗传转化、品种优化提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料本研究试验材料为马铃薯晋薯16 号的无菌脱毒苗，由山西农业大学农学院马铃薯分子育种实验室提供。

1.1.2 生化试剂激素（6-BA、NAA、GA3等）及MS 培养基等其他常用的生化试剂购自上海生工生物工程公司。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗繁殖培养基及培养条件MS 培养基干粉40g，加蒸馏水定容至1L，搅拌加热至完全溶解，使用1mol/L NaOH 调整pH 值至5.8～6.0，121℃高压灭菌20min 后冷却备用。

在马铃薯分子实验室培养间进行无菌苗繁殖培养，培养温度25℃，光周期为光16h/暗8h，光照强度2000～2500lx。白天采用日光灯带与红蓝光灯带同时补光。

1.2.2 外植体表面消毒取生长4 周的晋薯16 号无腋芽脱毒苗茎段，用以下方法进行消毒：75%的酒精浸泡30s，1.5%、2%和2.5%的次氯酸钠依次浸泡60s，无菌水清洗3 遍后用滤纸吸干外植体表面液体，置于MS 基础培养基中培养，每皿20 个茎段，共3 皿，5d 后统计污染数量。

1.2.3 愈伤组织诱导培养基（CIM）及培养条件MS培养基加不同浓度组合的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）和TMT（特美汀）。NAA 设置3 个浓度，分别为0.3mg/L、0.5mg/L 和1.0mg/L；6-BA设置3 个浓度，分别为1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；TMT 为200mg/L。培养条件和无菌苗繁殖培养相同。

1.2.4 愈伤组织分化培养基（CDM）及培养条件MS 培养基加不同浓度组合的6-BA、GA3（赤霉素）、ZT（玉米素）和TMT。6-BA 设置3 个浓度，分别为1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；GA3设置5 个浓度，分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L 和2.5mg/L；ZT 为1.0mg/L；TMT 为200mg/L。培养条件和无菌苗繁殖培养相同。

1.2.5 不同外植体的筛选选择健壮晋薯16 号无菌苗，培养基使用激素配比为NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+TMT 200mg/L 的CIM 培养基，在马铃薯分子实验室培养间进行愈伤组织诱导，10d 后转入激素配比为ZT 1.0mg/L+GA31.0mg/L+TMT 200mg/L 的CDM 培养基，每10d 更换CDM 培养基，随时观察分化情况。培养温度25℃，光周期为光16h/暗8h，光照强度2000～2500lx。

采取不同外植体培养：（1）茎段：取1cm 长无腋芽茎段，置于CIM 培养基上；（2）叶片：取边长约0.5cm 并留部分叶柄的叶片，置于CIM 培养基上。

1.2.6 根的诱导选用1cm 左右带腋芽的茎段，分别接入含有30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的MS 培养基内诱导不定根。每皿20 个茎段，每个浓度3 皿，分3 个重复，培养温度25℃，光周期为光16h/暗8h，光照强度2000～2500lx，随时观察不同培养基上根的生长情况，30d 后统计结果。

1.3 数据统计及分析愈伤组织诱导率、芽分化率、根分化率的计算方法见以下公式。试验数据统计和分析使用Microsoft Excel 和SPSS 18 完成。

愈伤组织诱导率=出现愈伤外植体数/外植体总数×100%

芽分化率=分化出不定芽的外植体数/外植体总数×100%

根分化率=出现不定根的外植体数/外植体总数×100%

污染率=污染的外植体数/外植体总数×100%

2 结果与分析

2.1 外植体的筛选理论上任何外植体在合适的条件下均可脱分化形成愈伤组织，但在实践中，外植体不同，愈伤组织诱导及不定芽分化的效果不同。试验选取晋薯16 号无菌苗健壮的叶片及无腋芽茎段为外植体，进行愈伤组织和不定芽的诱导。结果表明，愈伤组织诱导阶段，茎段产生较多的愈伤组织，颜色淡绿色，质地紧密；不定芽诱导阶段，茎段产生不定芽比叶片速度快且数量多。茎段和叶片的愈伤组织诱导率分别为60%和25%，因此茎段可作为最佳外植体。

2.2 不同浓度次氯酸钠消毒效果消毒的原则是杀死材料上附着的微生物又不伤害外植体的活细胞。试验使用3 种浓度次氯酸钠对外植体表面进行消毒，结果表明，1.5%次氯酸钠不能有效杀灭外植体上的微生物，外植体颜色淡绿，但污染率20%～30%；2%次氯酸钠可杀灭多数微生物，外植体两端有轻微变白现象，并不影响后期愈伤组织诱导及分化；2.5%次氯酸钠可有效杀菌，但因浓度高，外植体细胞受损严重，外植体两端出现白化死亡现象。因此可选择使用2%的次氯酸钠对晋薯16 号茎段外部消毒。

2.3 不同激素及浓度组合对愈伤组织诱导率及质量的影响愈伤组织指在无菌条件下将外植体某一部分置于适宜的培养环境中，加入浓度配比适合的植物激素，经诱导期、分裂期及形成期3 个阶段形成的一团不定型组织（由薄壁细胞组成）。因此愈伤组织的诱导率及诱导质量主要受培养条件、植物激素的组合及浓度配比的影响。

晋薯16 号茎段接种到含NAA 和6-BA 的愈伤组织诱导培养基上培养3d 左右，茎段两端切口处开始膨大，5d 左右出现愈伤组织，愈伤诱导率达70%以上。愈伤组织诱导率及愈伤组织形成质量因2 种激素配比浓度不同出现差异。

由表1 可知，愈伤组织质量及诱导率受NAA和6-BA 影响，6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L、6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L、6-BA 2.5mg/L+NAA 1.0mg/L这3 组诱导培养基中，愈伤组织生长旺盛，质地紧密有光泽，愈伤组织量多且颜色呈黄绿色，茎段无白色不定根出现，诱导率可达87%以上。CIM5 愈伤组织边缘无褐变，后期在组织分化培养中表现也较好，CIM7 和CIM8 愈伤组织后期褐变严重，所以CIM5 为愈伤诱导最佳培养基。培养10d 后观察，由于培养基中水分、养分的损耗及代谢时有毒物质的积累，愈伤组织块生长速度渐缓，两端出现较轻的褐化现象，此时需及时转移到CDM 培养基中，否则褐化现象将加剧直至茎段死亡。

表1 MS 添加不同浓度NAA、6-BA 对晋薯16 号愈伤组织的影响

2.4 不同激素及浓度组合对愈伤组织分化率影响

由表2 可知，激素6-BA、GA3和ZT 的组合有利于晋薯16 号不定芽的产生，组合6-BA 2.5mg/L+GA31.5mg/L+ZT 1.0mg/L、6-BA 1.0mg/L+GA31.0mg/L+ZT 1.0mg/L 和6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L芽分化率普遍比较高，可达23%以上，CDM5 的芽分化率最高，达32.6%，分化速度较快，两周左右可以观察到较多丛生芽。随着GA3浓度提高褐化率也提高，添加ZT 对褐化情况有一定抑制作用，愈伤组织量多且质地紧密，分化的速度快。本组实验中培育出的丛生芽质量好、数量多、容易扩繁，扩繁后的试管苗也比较健壮，说明反式玉米素核苷对马铃薯愈伤组织诱导丛生芽有促进作用。

表2 MS 添加不同激素组合及浓度对晋薯16 号愈伤组织分化的影响

2.5 蔗糖对晋薯16 号生根的影响使用马铃薯晋薯16 号带腋芽的茎段为外植体，在添加了30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的根诱导培养基上培育5～6 周后，观察生根情况。由图1 可知，随着蔗糖浓度的增加，生根率呈先增加后降低的趋势；蔗糖浓度为50g/L时，生根率最高，为81.3%；蔗糖浓度继续增加，生根率下降。因此，蔗糖浓度为50g/L 为晋薯16 号生根最适宜的浓度。

图1 蔗糖浓度对晋薯16 号根诱导的影响

3 讨论与结论

在马铃薯再生体系外植体的选择上，马铃薯茎段、叶片及茎尖通过组织诱导及分化形成再生植株的再生率较高[6，12]，被认为是经过诱导得到再生植株很好的材料。不同基因型外植体对不同的诱导剂敏感程度不同，对于马铃薯来说，常用的生长素是NAA 和2，4-D，细胞分裂素是6-BA，基础培养基为MS[13-15]。

本试验以马铃薯品种晋薯16 号为外植体，建立了无菌外植体通过愈伤组织诱导及分化途径的植物离体组织培养体系。愈伤组织诱导通过激素6-BA和NAA 的组合产生，诱导愈伤组织分化丛生芽通过激素6-BA、GA3和ZT 的组合产生，得出晋薯16 号外植体茎段使用浓度为2%的次氯酸钠消毒效果较好，愈伤诱导外植体选择茎段较好，晋薯16 号愈伤组织诱导培养基以MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L为佳，愈伤组织分化培养基以组合MS+6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L 为佳，根的诱导使用50g/L 蔗糖。

本研究对山西主要种植品种晋薯16 号高效再生体系进行了建立优化，为后续农杆菌介导的愈伤转化体系的创建提供重要的基础和指导，对晋薯16号的品种改良具有重要意义。