高抗镉球孢白僵菌筛选及其吸附性能研究

余甜甜，张丽杰，马争发，张 湄，谭维群，吴前林

（重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 404100）

随着工业发展以及人类活动的进行，重金属逐渐在人类生活的周边环境中积累，其具有毒性大、隐蔽性强、易积累、难降解的特点，并参与食物链循环，最终在生物体内积累，对生态环境和人体健康的危害极大［1－2］。

微生物法是处理重金属污染的重要手段之一，微生物筛选及其吸附重金属的机理研究已有大量报道，但是重金属镉的毒性大，对微生物的生长及群落多样性的抑制作用较大［3－5］，因此高耐受重金属镉的微生物的筛选及其吸附效果的研究较少。据文献报道，有些微生物经过驯化可具有重金属高耐受性，高耐镉细菌贪铜菌属细菌的最大耐受浓度达到2 248．2 mg／L，高耐镉芽孢杆菌最大耐受浓度达到3 900 mg／L，真菌相对于细菌及放线菌具有较高的重金属耐受性，高耐镉真菌－淡紫拟青霉菌的最大耐受浓度达到80 mmol／L，在Cd2＋浓度为100 mg／L时，吸附率为68．8%［6－7］。本实验从富集了大量重金属的化工厂旁土壤中筛选出一株丝状真菌——球孢白僵菌。球孢白僵菌是国内应用最广泛的一种昆虫病原真菌［8］，球孢白僵菌的重金属吸附能力已有相关报道，在此次研究中，球孢白僵菌经过梯度驯化后，展现出对镉具有高耐受能力和高吸附能力，真菌通过生物吸附或生物积累等生物代谢活动有效地去除重金属，真菌中的曲霉、根霉、木霉和青霉的金属耐受性与其去除金属的能力之间具有相关性［9－12］，因此驯化后菌株的吸附效果研究是必要的。本文对筛选出的球孢白僵菌在平板上进行耐受性研究，探究了该菌株对低浓度以及高浓度镉的吸附效果，以期为重金属污染环境的修复提供参考。

1 材料和方法

1．1 主要材料与试剂

1．1．1 土壤来源

采集自重庆市民丰化工厂周边土壤，使用土壤采集器取样距离地表5～20 cm的土壤。

1．1．2 实验试剂

酵母膏提取物，分析纯，北京奥博星生物技术有限公司；蛋白胨，分析纯，北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠，分析纯，成都市科龙化学试剂厂；琼脂粉，分析纯，重庆市北碚化学试剂厂；氯化镉，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；硝酸，分析纯，上海恒信化学试剂有限公司；磷酸氢二钾，分析纯，浙江省温州市东开化工试剂厂。

1．1．3 实验仪器

电热恒温水浴锅，HHS，上海博讯实业有限公司；电子天平，BSM220．4，上海卓精电子科技有限公司；高速冷冻离心机，SIGMA 3 18ks，成贯仪器上海有限公司；冷冻离心机，TGL 16M，湖南湘仪离心机有限公司；紫外分光光度计，721，重庆川仪分析仪器有限公司；高压灭菌锅，GI54DWS，致微仪器有限公司；超净工作台，IS09001，上海智城分析仪器制造有限公司；生化培养箱，SPX 80B，天津宏诺仪器有限公司；pH酸度计，PHSJ 4F，上海仪电科学仪器股份有限公司；凝胶电泳仪，DYY 8C，北京六一生物科技有限公司；原子吸收光谱仪，AA800，铂金埃尔默仪器上海有限公司。

1．1．4 培养基配方

液体培养基：酵母粉（5 g／L）；蛋白胨（10 g／L）；氯化钠（5 g／L）。

固体培养基：酵母粉（5 g／L）；蛋白胨（10 g／L）；氯化钠（5 g／L）；琼脂粉（18 g／L）。

1．2 实验方法

1．2．1 耐镉菌株的土样采集

实验选取民丰化工厂旁土壤作为取样区。在去掉土壤表层杂物和浮土后，使用土壤采集器取样距离地表5～20 cm的土壤，以梅花五点法进行打孔采样，将五点样品混合均匀后用聚乙烯采样袋收集并封口，最后保存在3～8℃的冰箱中，备用。

1．2．2 耐受镉离子球孢白僵菌的筛选

称10 g采集的土壤，与无菌水充分混合，静置30 min。取1 mL上清液加入到培养基中，30℃，170 r／min摇床中培养2 d，待培养基变得浑浊，取1mL的菌悬液加入到含镉浓度400 mg／L的培养基中，培养4～5 d后取200μL菌悬液涂布到镉浓度在400 mg／L的LB固体平板上培养，将生长状况良好的单菌落逐步转接到更高浓度的平板上，进行驯化，最后将得到的单菌落在平板上划线转接3次以上进行菌种纯化。

1．2．3 菌属鉴定

真菌物种鉴定是使用ITS rDNA作为Marker片段，根据真菌rDNA的ITS区设计出特异性引物进行PCR扩增，扩增出基因中ITS序列，随后进行电泳检测。利用DNA凝胶回收试剂盒回收扩增出来的ITS序列，并由上海美吉公司使用3730XL测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与NT数据库进行比对，获得相似序列的物种信息，借助同源比对的方法辅助判断物种信息。

1．2．4 扫描电镜观察

用含镉2 000 mg／L的液体培养基与不含镉的液体培养基培养菌体，待培养基中菌体充分生长后，分别取样1 mL，4 000 r／min离心8 min，去上清，用2．5%的戊二醛溶液固定菌体3 h，随后使用磷酸缓冲液冲洗3次，乙醇梯度脱水30%、50%、70%、85%、95%各1次，100%乙醇2次，15～20 min／次，最后进行临界点干燥，使用扫描电镜观察菌体表面形貌的变化。

1．2．5 梯度驯化以及耐受性测定

将分离的单菌落接种于LB液体培养基中进行扩增培养，培养条件为：30℃，170 r／min，培养24 h。将活化后的菌液取1μL点样到含镉分别为50、500、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 mg／L的固体培养基上进行梯度培养，并配制对照平板（不含金属盐）。所有平板都是在（25±2）℃下培养14 d，以观察真菌生长情况。真菌通过在高金属浓度下的大量生长来表达对金属的耐受性。可以通过耐受指数（TI）对耐受程度进行量化，在整个培养期间的隔日对平板拍照，测量菌落的半径并计算耐受性系数（TI）［15－16］：

1．2．6 重金属离子吸附效果优化

1）最适温度的优化

将菌株培养至对数期的菌种以2．5%的接种率接种到LB液体培养基中，总体积为40 mL，镉浓度为100 mg／L，将三角瓶置于不同温度下（10、15、20、25、30、35、40℃），170 r／min振荡培养，培养至3 d后取菌液，8 000 r／min离心5 min。使用原子吸收光谱仪测量上清液中的镉离子含量，上述试验重复3次。

2）最适pH值的优化

按照1）的操作，将菌液接种到pH值分别为4 0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0的培养基中，培养温度为25℃，培养结束后测量镉离子含量。

3）最适接种量的优化

按照1）的操作，将培养至对数期的菌液分别以接种量2．5%、5%、7．5%、10%接入装有LB液体培养基中，培养温度为25℃，培养结束后，测量镉离子含量。

4）重金属浓度对菌株吸附率的影响

将驯化后的菌株培养至对数期的菌种以7 5%的接种率接种到LB液体培养基，总体积为40 mL，液体培养基中镉浓度分别为20、40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 mg／L，置于25℃下170 r／min振荡培养。隔天取样，取样时长为7 d，8 000 r／min离心5 min。使用原子吸收光谱仪测量上清液中的重金属含量，上述试验重复3次。

1．2．7 液体培养基中真菌对重金属的吸附效果

测量之前配制标准溶液，根据仪器的使用范围配制浓度梯度标液，使用配标准溶液制作标准曲线。根据1．2．5的实验方法，将菌液培养3 d后，将样品离心（8 000 r／min，5min）以获得无细胞上清液，使用原子吸收光谱（AAS）用于金属定量检测。去除的金属百分比（Y，%）为

式中：C0为初始金属浓度（mg／L）；C1为最终金属浓度（mg／L）。

2 结果与分析

2．1 菌株的形态特性

菌落在LB固体平板上生长状况如图1（a）所示，菌落呈发散状，白色，中间褶皱、菌落薄，质地呈现毛绒状，菌落底部无色或淡黄色，如图1（b）。在10×100倍显微镜下，分生孢子透明、壁薄呈球形或椭圆形，初步判断该菌株为丝状真菌。

图1 菌株Z1在LB培养基上的菌落形态特征

2．2 菌株Z1的分子生物学鉴定

琼脂凝胶电泳结果如图2所示，DL2000条带分布：2 000、1 000、750、500、250、100 bp，可知真菌的ITS序列在500 bp左右，利用NCBI数据库中的BLAST比对该菌的真菌rDNA的ITS区，并构建进化树，如图3，根据BLAST结果显示与Beauveria bassiana B1和eauveria bassiana strain ARP14同源性为99%，与Beggiatoa leptomitoformis strain D 402和Beggiatoa alba同种，菌株Z1为白僵菌。ITS序列测序峰图见图4。

图2 电泳结果

图3 菌株Z1的基于ITSrRNA序列的 系统发育树示意图

图4 ITS序列测序峰图

2．3 扫描电镜观察真菌表面形态变化

如图5（a）所示，扫描电镜观察下可以看到旺盛生长的菌丝，菌丝光滑，但在菌丝或分生孢子梗上未观察到孢子，可能是由于取样时间的选择不恰当。在含镉的培养基中培养的菌体的扫描电镜图如图5（b）所示，菌体并无明显变形，仍呈现光滑细长状，但其表面有微小物质附着，此次电镜观察到Cd2＋与菌丝发生复杂的相互作用后沉积在菌丝表面的现象。

图5 菌株Z1分别在不含镉与含镉液体培养基中的 扫描电镜图

2．4 菌株Z1对重金属镉的耐受性

真菌在高金属浓度下的生长情况可表示其对金属的耐受性，可以通过耐受指数（TI）对耐受程度进行量化：TI值为0，表示对重金属完全没有耐受性；TI＜1，表明相对于对照，重金属胁迫下真菌生长受到抑制；TI值为1，表示相对于对照组，重金属胁迫下真菌的生长相似；TI＞1，表明重金属胁迫下真菌的生长超过对照，因此，高TI表明菌株良好的金属耐受性。将TI值（14 d）作图6，真菌在金属胁迫的情况下可存在5个生长阶段：（a）生长滞后；（b）快速生长，但绝对生长受到抑制，即TI＜1；（c）生长率下降；（d）类似生长，TI值在1附近；（e）增强生长，即TI＞1，有些菌株应对重金属胁迫时没有增强生长阶段［14］。白僵菌Z1在重金属浓度为50～3 000 mg／L时无滞后生长，耐受性系数TI（0．48～0．88），表现出高耐受性［14］；在重金属浓度为3 500～9 000 mg／L时存在滞后生长，滞后时间为1 d，耐受性系数TI（0 14～0．50）；在重金属浓度为50～9 000 mg／L时，白僵菌Z1均未表现出增强生长阶段，该菌株在b阶段TI值的增长速率较高，在c阶段TI值的降幅度较小，表现出较强的重金属耐受性［14］。

2．5 重金属吸附优化

2．5．1 温度优化实验

白僵菌Z1的最适温度如图7所示，在实验的温度范围内，Z1对重金属的镉的吸附率呈现先上升后下降的趋势，25℃达到最大吸附率60 1%。白僵菌Z1对镉的吸附率变化与温度变化相关，温度在20～30℃对重金属镉的吸附效果较好，温度过高、过低均对重金属镉的吸附产生不利影响。

图6 白僵菌Z1对重金属镉的耐受性结果

图7 温度对菌株Z1吸附Cd2＋的影响

2．5．2 pH优化实验

白僵菌Z1的最适pH值如图8所示，在实验的pH值范围内，Z1对重金属的镉的吸附率呈现先上升后下降的趋势，在pH值为6时，达到最大吸附56．17%。pH值降低或升高均对菌株Z1吸附镉产生负面影响。

图8 pH对菌株Z1吸附Cd2＋的影响

2．5．3 最适接种量的优化

白僵菌Z1的最适接种量如图9所示，白僵菌Z1对重金属镉的吸附率呈现先上升后下降的趋势，随着接种量的增加，白僵菌Z1的吸附率也随之增加，在接种量为7．5%时，达到最大吸附率76．2%。

图9 接种量对菌株Z1吸附Cd2＋的影响

图10 菌株在不同镉浓度下的最大生长量直方图

2．5．4 重金属浓度－时间对菌株吸附率的影响

在不同的Cd2＋浓度下，菌株Z1的生长情况均良好（见图10）；连续测定菌株Z1对Cd2＋的吸附率，结果如图11所示，由图11可知：菌株Z1对Cd2＋的吸附存在累积的过程，随着时间的增加，菌株Z1对Cd2＋的吸附率呈现先升高后下降的趋势。在实验范围内（20～1 000 mg／L），随着Cd2＋浓度的不断增加，菌体最大吸附率呈现先升高后下降的趋势，在镉离子浓度为40 mg／L时，吸附率可达97．4%。在20～40 mg／L，随着浓度的增加，镉的吸附率逐渐增加；40～100 mg／L，随着浓度的增加，菌体对Cd2＋的吸附率逐渐下降。在较高的重金属浓度范围内（200～1 000 mg／L），菌株Z1的吸附率呈现升高的趋势，在重金属高达1 000 mg／L时，菌体对Cd2＋的吸附率可达到92．1%（见图12）；菌株Z1对Cd2＋的单位吸附率在实验浓度范围内先升高后降低，在1 000 mg／L时达到最大，单位吸附率达到101．26 mg／g（见图13）。

图11 菌株Z1对Cd2＋的吸附效果

图12 菌株Z1对不同浓度Cd2＋的最大吸附率

图13 菌株Z1对不同浓度镉的单位吸附量直方图

3 讨论

微生物处理重金属污染具有高效、成本低、无二次污染的优点，其中利用真菌的吸附作用是治理重金属污染的重要手段之一。本次研究通过在实验室中进行耐镉梯度驯化后得到高耐镉且具有高吸附率的球孢白僵菌Z1，对该菌株的镉耐受程度、吸附效果及影响因素进行了深入的探讨，研究表明球孢白僵菌Z1在固体培养基中能耐受Cd2＋的浓度高达9 000 mg／L，与已筛选出的耐镉真菌绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、青霉（Penicillium sp．）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比具有高耐受性［15－18］，同时与高耐镉菌株相比具有高吸附率。Gola等［19］对球孢白僵菌对多种重金属的吸附效果进行研究，其中球孢白僵菌对镉的最大耐受浓度为200 mg／L，对初始浓度为30 mg／L的Cd2＋的吸附率为63．4%，本文中经过梯度驯化后得到的球孢白僵菌Z1对镉Cd2＋的浓度高达9 00 mg／L，且其对Cd2＋的吸附效果也大为提高，对初始浓度为20 mg／L的Cd2＋的吸附率为96．4%，对初始浓度为40 mg／L的Cd2＋的吸附率为98．0%。

研究表明：温度是影响重金属吸附效果的重要因素，温度对该菌株吸附Cd2＋能力影响的敏感程度要远大于pH的影响，在20～30℃时，球孢白僵菌Z1对Cd2＋的吸附效果要明显优于其他温度，可能是在这个温度范围内，菌株在应对镉胁迫时能更好地分泌抗氧化胁迫的酶类物质，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化胁迫的酶类物质能减轻重金属引起的生理毒害［20］，在实验的pH值范围内，pH值呈现中性时具有较好的吸附效果；实验表明菌液接种量为7．5%吸附效果最好，菌株对Cd2＋效果并未随着接种量的增加而增强，这是因为真菌细胞细胞壁上含有弱酸性羧基基团，带正电荷，在重金属溶液中，细胞表面活性基团中的质子与重金属离子发生离子交换，将重金属离子吸附在细胞表面，而当溶液中菌株的接种量过多，真菌细胞间因为均带正电荷存在相互排斥作用和吸附位点相互竞争作用进而影响其对带正电荷的重金属离子的吸附效率［1］。

在菌株Z1吸附Cd2＋的研究中发现：随着时间的延长，球孢白僵菌Z1对Cd2＋的吸附能力逐步升高，在第4～5 d达到最大吸附率，随后吸附率下降，可能是因为菌体死亡后积累在菌体内部的镉释放到培养液中，Cd2＋的浓度也影响吸附重金属Cd2＋的效果，在实验范围内（20～1 000 mg／L），随着Cd2＋浓度的不断增加，菌体对它们的吸附率的总体趋势是先下降后升高，在重金属浓度（20～100 mg／L）时对Cd2＋的吸附效果较好，吸附率可达到76．7%以上，在重金属浓度为200 mg／L时吸附率最低为62．5%，而在较高的重金属浓度范围内（200～1 000 mg／L），球孢白僵菌Z1对Cd2＋的吸附率呈现升高的趋势，在重金属高达1 000 mg／L时，菌体对Cd2＋的吸附率可达到92．1%。在低浓度Cd2＋环境下菌体的细胞壁表面能够提供大量的吸附活性位点，所以菌体对金属离子的吸附率较高，随着Cd2＋浓度的不断增大，细胞壁表面的吸附位点达到饱和，降低了Cd2＋的吸附率；在Cd2＋浓度较高的培养基中，菌株吸附率却逐渐上升可能是真菌应对较高浓度重金属胁迫时，对重金属不单单依靠细胞壁表面基团的吸附，还有胞内沉淀等生物功能活动进行，生物吸附与生物积累等机制同时进行以抵御镉对菌体的胁迫［21－23］。本次实验筛选出的对镉具有高耐受性且高吸附率的球孢白僵菌Z1可为微生物处理重金属废水和土壤提供新的高效且廉价的选择，下一步可从基因层面对镉的高耐受性进行深入分析，为构建高效率的基因工程菌提供理论基础。