四川华吸鳅对盐度的耐受性研究

陈小江，左华丽，李 伟，吴建顾

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.上海市海丰水产养殖有限公司，江苏 盐城 224153）

四川华吸鳅 (Sinogastromyzon szechuanensis) 隶属于平鳍鳅科、华吸鳅属，分布于长江上游及其支流，西南丘陵河流中[1]。四川华吸鳅味道鲜美，富含必需氨基酸和不饱和脂肪酸，营养价值高，且具有良好的观赏价值[2-3]。人类活动导致四川华吸鳅的生境被破坏，种群资源量大为减少[4]。1999 年四川华吸鳅被重庆市政府列入重点保护对象，2011 年纳入世界自然保护联盟 (IUCN) 濒危物种红色名录[5]。目前对四川华吸鳅的研究主要集中在资源调查[6-7]、形态测量[8-10]、麻醉剂选用[5,11]、繁殖发育[12-13]、线粒体全基因组及系统发育分析[14]等方面。

盐度是影响鱼类生存和生长的重要指标，在养殖生产中，可通过提高盐度来治疗疾病，但超过鱼类的耐受范围又会导致其死亡。目前有关鱼类对盐度耐受性研究主要有鲻鱼 (Mugil cephalus)[15]、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)[16]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[17]、孔雀鱼 (Poecilia reticulata)[18]、澎泽鲫 (Carassius auratusvar.pengza)[19]、异育银鲫 (C.auratus gibelio)[20]、麦穗鱼 (Pseudorasbora parva)[21]、昆明裂腹鱼 (Schizothorax grahami)[22]、黄鳝 (Monopterus albus)[23]、咸海卡拉白鱼 (Chalcalburnus chalcoides aralensis)[24]等，四川华吸鳅对盐度的耐受能力尚未见报道。本文首次研究了四川华吸鳅对盐度的耐受性，旨在为该物种保护及人工养殖提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2017 年10 月—2018 年11 月，四川华吸鳅采于四川沱江水系内江段，活体运输至江苏农牧科技职业学院水产养殖室，养殖1 年以上，使其完全适应人工饲养环境。2019 年12 月开展本次试验，试验用水为曝气48 h 的自来水，溶解氧质量浓度大于8.0 mg·L−1，水温 (15.5±0.5) ℃，pH (7.6±0.1)。挑选规格较均匀，体质量 (8.495±1.11) g，健康无病、活力好的四川华吸鳅，试验前停食24 h。

1.2 实验方法

1.2.1 四川华吸鳅对盐度的耐受性 预实验的盐度梯度按等差数列1 g·L−1配制6～15 g·L−1的氯化钠 (NaCl) 溶液，共10 组，每组1 个3 L 锥形瓶，瓶中放入四川华吸鳅5 尾，充气并观察其活动状况，记录24、48、72 和96 h 的死亡数。24 h 鱼全部死亡的最低盐度为12 g·L−1，96 h 鱼全部存活的最高盐度为7 g·L−1。根据预实验结果，按照等对数间距设置盐度组8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22、12 g·L−1，每组3 个平行，每个平行 (3 L 锥形瓶) 10 尾，气泵充气补氧。观察四川华吸鳅行为活动状况，准确记录24、48、72 和96 h的死亡数并及时捞出死鱼，利用线性回归法计算半致死浓度(LC50)，并计算安全浓度。

1.2.2 盐度胁迫对四川华吸鳅呼吸频率的影响各试验组盐度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22、12 g·L−1，待四川华吸鳅安定后启动试验，为期4 h。在试验开始与结束时，分别在每个组随机选择四川华吸鳅3 尾，记录每分钟呼吸次数。

1.2.3 盐度胁迫对四川华吸鳅窒息点的影响 依据96 h 全部存活时的最高盐度7 g·L−1，设置盐度0、1、2、3、4、5、6、7 g·L−1组，每组3 个平行，每个平行 (1 000 mL 锥形瓶) 内放入四川华吸鳅6 尾，试验期内不喂食。第一组充分曝气4 h 后停止曝气，用保鲜膜密封，有50%失去平衡、昏迷或濒死，立即取水样，采用GB 7489—87 测溶解氧，即为窒息点。第二组充分曝气96 h 后停止曝气，其余步骤同第一组，测其窒息点。

1.3 数据处理

安全浓度计算公式[25]：

所得数据经Excel 2010 处理，利用SPSS 19.0进行单因子方差分析 (One-way ANOVA)，组间差异采用Duncan's 多重比较，当P<0.05 时差异显著，统计值采用“平均值±标准误 ()”表示。

2 结果

2.1 盐度对四川华吸鳅的毒性

四川华吸鳅在盐度梯度8、8.56、9.16、9.8、10.48、11.22 和12 g·L−1各组24、48、72 和96 h的死亡率见表1，利用累计死亡率和盐度作线性回归，各时间点的 LC50见表2。四川华吸鳅24、48、72 和96 h 的LC50分别为10.50、10.15、9.83和9.46 g·L−1，安全浓度为2.32 g·L−1。

表1 不同盐度下四川华吸鳅的死亡率Table 1 Mortality of S.szechuanensis at different salinity levels

2.2 盐度胁迫下四川华吸鳅的呼吸频率

0 h 组和4 h 组，四川华吸鳅的呼吸频率均随盐度升高而增加 (图1)。0 h 组，盐度为4 g·L−1时的呼吸频率[(177±10.42) 次·min−1]显著高于0 g·L−1组[(156.33±10.97) 次·min−1](P<0.05)；4 h 组，盐度为2 g·L−1时的呼吸频率[(150.0± 5.57)次·min−1]显著高于0 g·L−1组[(135.33±8.39)次·min−1](P<0.05)。盐度介于0～7 g·L−1时，4 h 组的呼吸频率显著低于0 h 组 (P<0.05)，盐度介于8.56～12 g·L−1时，4 h 组的呼吸频率显著高于0 h组 (P<0.05)。

表2 盐度对四川华吸鳅不同时间的半致死浓度Table 2 Lethal concentration of salinity to S.szechuanensis at different time

图1 盐度对四川华吸鳅呼吸频率的影响同一指标中，有1 个字母相同则组间无显著差异 (P>0.05)，反之则有显著差异 (P<0.05)，水温为 (15.5±0.5) ℃，后图同此Figure 1 Effect of salinity on respiration frequency of S.szechuanensisValues with the same and different letters for the same index indicate insignificant (P>0.05) and significante difference (P<0.05),respectively;water temperature was (15.5±0.5) ℃.The same case in the following figure.

2.3 盐度胁迫下四川华吸鳅的窒息点

四川华吸鳅在0～7 g·L−1各盐度组96 h 的窒息点均显著低于4 h 后的窒息点 (P<0.05，图2)。4 h组，盐度为2 g·L−1时窒息点最低[(0.81±0.02)mg·L−1]，盐度为7 g·L−1时窒息点最高[(1.04±0.09)mg·L−1]，显著高于2 g·L−1组 (P<0.05)。96 h 组，四川华吸鳅的窒息点随盐度增加而升高，窒息点最低值出现在0 g·L−1组和1 g·L−1组[(0.60±0.1)mg·L−1]，最高值出现在7 g·L−1组[(0.88±0.09)mg·L−1]，盐度3 g·L−1以上，四川华吸鳅的窒息点显著高于0 g·L−1和1 g·L−1组 (P<0.05)。

图2 盐度对四川华吸鳅窒息点的影响Figure 2 Effect of salinity on suffocation point of S.szechuanensis

3 讨论

3.1 四川华吸鳅对盐度的耐受力

盐度常视为阻碍因子，当盐度发生变化时，无论高渗环境，还是低渗环境，鱼类均会改变其代谢途径，耗费大部分能量用于渗透和离子调节，而离子的进出主要依赖鳃丝泌氯细胞[26]。当盐度的变化幅度超过鱼类耐受范围时，其血液生化指标[27]、非特异性水解免疫酶、非特异性抗氧化免疫酶和各类消化酶的活性均会受到严重影响，甚至引起死亡[28]。不同种类的鱼、同种类不同规格的鱼的渗透能力不同，这取决于先天进化及后天驯化[24]。

盐度对四川华吸鳅和其他几种鱼类的半致死浓度，随时间的增加而降低 (表3)，说明对盐度的耐受力随时间延长而逐渐减弱。安全浓度从大到小排列顺序为：咸海卡拉白鱼 (成鱼)、黄鳝、黑龙江泥鳅 (Misgurnus mohoity dybowsky)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)、咸海卡拉白鱼 (幼鱼)、达里湖高原鳅 (Triplophysa dalaica)、麦穗鱼、四川华吸鳅、昆明裂腹鱼、鲢 (幼鱼)、彭泽鲫(幼鱼)。盐度对四川华吸鳅24、48、72 和96 h的LC50分别为10.50、10.15、9.83 和9.46 g·L−1，安全浓度为2.32 g·L−1，与其他鱼类 (成鱼) 相比仅高于昆明裂腹鱼。地球上淡水含盐的质量浓度为0.01～0.5 g·L−1、海水含盐的质量浓度为16～47 g·L−1(一般35 g·L−1)，表明四川华吸鳅虽不能适应海水养殖，但能适应所有淡水，可承受较低盐度的水环境。在安全浓度范围内，适宜盐度能降低淡水鱼类疾病危害，提高运输、驯化、养殖和育苗成活率等，这对开展四川华吸鳅保护工作具有十分重要的意义。

表3 四川华吸鳅和部分鱼类对盐度耐受性比较Table 3 Comparison of salinity tolerance between S.szechuanensis and some fish

3.2 盐度胁迫对四川华吸鳅呼吸频率的影响

鱼类呼吸系统的变化可反映身体机能的变化，鱼类对水环境中某种因子的改变是否敏感，可通过呼吸频率这一指标进行初步判断。汪红军等[30]用斑马鱼 (Brachydanio rerio) 的呼吸参数成功监测水体的重金属离子如汞 (Hg2+)、铜 (Cu2+)、锌 (Zn2+) 等。Cairns 等[31]通过测定呼吸频率来监测锌对硬头鳟(Salmo gairdneri) 的安全浓度，发现未受影响的硬头鳟呼吸频率正常，受影响的硬头鳟呼吸频率明显改变[31]。

本研究发现，四川华吸鳅的呼吸频率随盐度升高而增加。0 h 组，盐度为4 g·L−1时的呼吸频率达到 (177±10.42) 次·min−1，显著高于盐度为0 g·L−1的呼吸频率[(156.3±10.97) 次·min−1，P<0.05]，盐度12 g·L−1时呼吸频率最高，达 (215.3±7.51)次·min−1，说明四川华吸鳅不断消耗能量来调节机体机能，以努力维持体内渗透压平衡。四川华吸鳅在0～7 g·L−1各盐度组内适应4 h 后的呼吸频率较初期 (0 h) 均下降，盐度等环境因子的改变会引起鱼类产生应激反应，并在低浓度范围适应一段时间后恢复[32]。4 h 组，盐度为2 g·L−1时的呼吸频率为 (150.0±5.57) 次·min−1，显著高于0 g·L−1组(P<0.05)；相比0 h 组，窒息点最低时对应的盐度由4 g·L−1降到2 g·L−1，表明在低盐度范围内随着时间延长，鱼的耐受能力降低[22]。经过剧烈的盐度变化，鱼体内产生大量氧自由基，若超出抗氧化系统清除能力或未及时清除，会导致机体应激损伤[33]。四川华吸鳅在8～12 g·L−1各盐度组，4 h 组的呼吸频率比初期 (0 h) 明显增加，表明高渗透压环境对四川华吸鳅造成伤害，需消耗大量能量来调节，因此呼吸频率异常增大，结果导致危及生命，这一点与耐受性实验结果一致，死亡率与盐度及作用时间成正相关。四川华吸鳅在盐度大于7 g·L−1适应4 h，其呼吸频率超过 (163.3±7.77) 次·min−1，表明机体已受到严重影响。若利用呼吸频率来监测盐度对四川华吸鳅的安全浓度，建议临界值为(150.0±5.57) 次·min−1。呼吸频率作为代谢的外在表现，而内在的生理生化指标变化情况有待进一步研究。

3.3 盐度对四川华吸鳅窒息点的影响

鱼类窒息点可作为判断鱼类对低氧耐受性的重要参数，对养殖生产有重要意义。四川华吸鳅在自然状态下，生活于溪流、吸附于岩石，对水环境溶氧需求较高。四川华吸鳅的窒息点与鲻、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、白甲鱼 (Onychostoma sima)、厚颌鲂 (Megalobrama pellegrini)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 接近，远高于一般的淡水鱼类如翘嘴鲌 (Erythroculter ilishaeformis)、中华倒刺鲃 (Spinibarbus sinensis)、鲤 (Cyprinus carpio)、鲢、草鱼 (Ctenopharyngodon idellus)、鳙 (Aristichthys nobilis)、鲫 (Carassius auratus) 等，相比真鲷 (Pagrosomus major) 等海水鱼类窒息点低很多(表4)。

表4 四川华吸鳅与几种鱼类窒息点比较Table 4 Comparison of suffocation points between S.szechuanensis and other fish

水生动物标准代谢消耗的能量，用于组织的修复和更新，维持机体内环境稳定[34]。本实验中，在0～7 g·L−1盐度胁迫下，适应4 h 后，2 g·L−1盐度组窒息点最低[(0.81± 0.02) mg·L−1]，这与尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[35]、禾花鲤 (Procypris merus)[34]、鲻[15]结果中的趋势相似。在0～7 g·L−1盐度胁迫下，适应96 h 后，各盐度组四川华吸鳅的窒息点均较4 h 下降，0～1 g·L−1窒息点最低[(0.60±0.06) mg· L−1]，这主要由持续饥饿导致代谢水平下降所致。短时间内适宜的盐度可降低四川华吸鳅的窒息点，随着时间延长，窒息点进一步下降，但盐度大于3 g·L−1各组的窒息点，显著高于0 g·L−1组和1 g·L−1组 (P<0.05)。

4 结论

研究四川华吸鳅对盐度的耐受性有利于开展资源保护，提高活体运输和暂养过程中成活率。根据本实验结果，盐度对四川华吸鳅24、48、72、96 h的半致死浓度分别为10.50、10.15、9.83 和9.46 g·L−1，安全浓度为2.32 g·L−1。以呼吸频率监测四川华吸鳅对盐度的安全浓度，实验初 (0 h) 为4 g·L−1，呼吸频率 (177±10.42) 次·min−1；适应4 h后为2 g·L−1，呼吸频率 (150.0±5.57) 次·min−1。此盐度与半致死浓度推算的安全浓度2.32 g·L−1相近，建议以适应4 h 后的呼吸频率不超过 (150.0±5.57) 次·min−1为参考，粗略监测盐度对四川华吸鳅的安全浓度。四川华吸鳅在0～7 g·L−1盐度胁迫下，适应96 h 后窒息点均下降，0～1 g·L−1时，窒息点最低 [(0.60±0.06) mg·L−1]。建议运输中盐度控制在0～1 g·L−1，饥饿驯化有助于增强四川华吸鳅的耐低氧能力，提高成活率；鉴于其窒息点相比一般淡水鱼类高，养殖、运输中应保证充足的溶解氧。盐度胁迫下四川华吸鳅的生理生化指标变化及应激反应机制机理有待进一步研究。