黄芪复方对急性低压缺氧大鼠视网膜DNA损伤的防护作用

李艳荣 辛晓蓉

四川省医学科学院 四川省人民医院眼科，成都 610072

急进高原时由于急性低压缺氧而引起一系列高原反应，严重者可发生高原肺水肿、高原脑水肿等高原病[1]。视网膜对缺氧非常敏感，低压缺氧状态下使血-视网膜毛细血管屏障功能受到影响而发生高原视网膜病变(high altitude retinopathy，HAR)[2]。视网膜功能和结构的完整性依赖于规律的氧气供应[2]。当机体处于低压缺氧环境时，细胞内氧化-抗氧化平衡发生紊乱，导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的积累，高浓度ROS可攻击蛋白质使其结构破坏、活性降低；攻击DNA分子使其发生突变，甚至断裂，促使视网膜神经细胞损伤和视网膜血管调节功能障碍，继而出现HAR[3-4]。目前从DNA影响机制及干预对HAR进行的研究相对较少，且近年来由平原进入高海拔地区的人越来越多，因此研究HAR的病理机制及治疗颇为重要。中药在防治高原疾病方面有其特色疗效，但目前对中药抗氧化研究主要以单药的形式进行，对中药复方的研究较少。与单药相比，复方在配伍过程中可能存在疗效增强、毒性和不良反应减轻等特点。本研究选取在长期应用过程中表现出有效自由基清除、抗氧化、免疫力调节等作用的黄芪、人参、枸杞、白术、玉竹和甘草组方为黄芪复方，通过模拟海拔高度5 km的缺氧环境探讨急性低压缺氧对大鼠视网膜DNA的影响和黄芪复方制剂对其的防治作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取雄性清洁级SD大鼠72只[实验动物许可证号：SCXK(陕)2018-001]，由西安交通大学动物实验中心提供，体质量(200±20)g，2～3月鼠龄。所有动物实验符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

1.1.2主要试剂及仪器 兔抗鼠p53抗体(WL01919，沈阳万类生物科技有限公司)、兔抗鼠组蛋白家族2A变异体(histone family 2A variant，H2AX)抗体(ab2893，美国Abcam公司)；山羊抗兔IgG(111-035-045，美国Jackson公司)；RNA逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒、RNAiso Plus(Trizol)(日本TaKaRa公司)；8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-hydroxyguanine glycolsylase，OGG1)、8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶(8-oxoguanine nucleoside triphosphatase，MTH1)RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。384孔RT-PCR板、RT-PCR反应膜、荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；光学显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1中药配制 黄芪复方(黄芪20 g、人参10 g、玉竹9 g、枸杞9 g、白术6 g、甘草6 g)，按传统方法煎煮过滤，并浓缩成11.76 g/ml的复方药物备用。

图1 各组大鼠视网膜组织病理学观察(HE×100，标尺=100 μm) 低氧模型组视网膜较常氧对照组和黄芪复方灌胃组增厚 A:常氧对照组 B:低氧模型组 C:黄芪复方灌胃组Figure 1 Histopathological observation of rat retina in each group (HE×100，scale bar=100 μm) The retina of hypoxic model group was thicker than that of the normal oxygen control group and Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group A：normal oxygen control group B：hypoxic model group C：Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group

1.2.2实验分组处理 按照计算机数字随机分配法将72只SD大鼠随机平均分为常氧对照组、低氧模型组和黄芪复方灌胃组，每组24只。低压氧舱模拟海拔5 km的高度，相对于海平面含氧量10.40%。氧分压为10.53 kPa，温度为18～24 ℃，湿度为37%～50%。常氧对照组大鼠在正常氧分压环境下喂养，温度为22～24 ℃，湿度为55%。低氧模型组和黄芪复方灌胃组大鼠置于低压氧舱内喂养，每24小时开舱0.5 h给大鼠加食、喂水，黄芪复方灌胃组大鼠每日黄芪复方制剂(0.1 g/kg)灌胃1次，低氧模型组大鼠每日等量生理盐水灌胃1次，持续7 d。

1.2.3组织病理学染色观察大鼠视网膜组织形态学的变化 于灌胃给药第7天，按照0.35 ml/100 g剂量腹腔内注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后，快速取出眼球，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定72 h，各组分别取8只眼球用于组织病理学及免疫组织化学检测。将固定好的标本常规脱水、浸蜡、包埋，制成厚4 μm石蜡切片。将石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，依次浸泡于梯度乙醇各3 min，苏木素染色10 min；洗去多余染液，体积分数0.5%盐酸乙醇分色，伊红染色5 min；依次浸泡于梯度乙醇，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。

1.2.4免疫组织化学法观察大鼠视网膜p53和H2AX的表达 各组取石蜡切片，贴片于质量分数0.05%多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后采用热修复法进行抗原修复，滴加p53(1∶ 100)或H2AX(1∶ 500)一抗，4 ℃孵育过夜；PBS漂洗3次，每次5 min，滴加相应二抗(1∶ 5 000)，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗3次，每次5 min，加入DAB显色液，苏木素复染，常规脱水、透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察呈棕色染色为阳性。

1.2.5实时荧光定量PCR法检测OGG1和MTH1的表达 各组分别取8只眼球，去除晶状体和玻璃体，并完整剥离视网膜。取1 ml Trizol试剂与视网膜混匀，提取组织总RNA，按照RNA逆转录试剂盒步骤逆转录合成为cDNA。将获取的cDNA分别加入各引物的反应体系中进行荧光定量PCR，各PCR引物序列见表1,反应体系为20 μl。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，循环40次。扩增后进行熔解曲线分析。以GAPDH为内参照，采用2-△△Ct方法计算各目的基因mRNA相对表达量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称引物序列(5’-3’)OGG1F:CCCGCTATGTATGTGCCAGTR:TGTCCAGGGCATTAAGCAGMTH1F:CATGGGACACCCACAGAGAGR:GGGAACCAGTAGCTGTCGTCGAPDHF:AGACAGCCGCATCTTCTTGTR:CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT 注:PCR:聚合酶链式反应;OGG1:8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶;MTH1:8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶;F:正向引物;R:反向引物 Note:PCR:polymerase chain reaction;OGG1:8-hydroxyguanine gly-colsylase;MTH1:8-oxoguanine nucleoside triphosphatase;F:forward primer;R:reverse primer

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析。本研究中计量数据经W检验证实符合正态分布，以mean±SD表示，组间均数经Levene检验证实方差不齐。采用随机分组单因素干预多水平研究设计，各组中MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相对表达量总体比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tamhane's T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠状态及视网膜组织形态学的变化

与常氧对照组相比，低氧模型组大鼠行动迟缓，嗜卧嗜睡，精神状态差，食欲减低。组织病理学检查结果显示，与常氧对照组大鼠视网膜相比，低氧模型组视网膜增厚，其中以神经纤维层及视网膜神经节细胞层增厚明显；与低氧模型组相比，黄芪复方灌胃组大鼠视网膜厚度有所降低(图1)。

2.2 各组大鼠视网膜DNA损伤标志物p53和磷酸化蛋白H2AX的表达变化

免疫组织化学染色法结果显示，常氧对照组神经纤维层、视网膜神经节细胞层、内丛状层及外丛状层p53呈弱阳性表达，低氧模型组视网膜各层中p53阳性染色程度较常氧对照组明显增强，而黄芪复方灌胃组视网膜p53阳性染色程度较低氧模型组减弱。常氧对照组视网膜中H2AX呈弱阳性表达，低氧模型组视网膜神经节细胞层及外丛状层H2AX阳性染色程度较常氧对照组明显增强，尤其以视网膜神经节细胞层阳性染色增强更为明显，而黄芪复方灌胃组视网膜中H2AX阳性染色程度较低氧模型组明显减弱(图2)。

图2 各组大鼠视网膜p53和H2AX免疫组织化学染色观察(DAB×100，标尺=100 μm) 低氧模型组大鼠视网膜p53和H2AX阳性染色强度较常氧对照组和黄芪复方灌胃组明显增强 A：常氧对照组 B：低氧模型组 C：黄芪复方灌胃组 H2AX：组蛋白家族2A变异体Figure 2 Immunohistochemical observation of p53 andH2AX in rat retina of each group(DAB×100，scale bar=100 μm) The positive staining intensity of p53 and H2AX in retina of the hypoxic model group was significantly enhanced than that of the normal oxygen control group and Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group A：normal oxygen control group B：hypoxic model group C：Radix Astragali seu Hedysari compound gavage group H2AX：histone family 2A variant

2.3 各组大鼠视网膜MTH1 mRNA和OGG1 mRNA的表达变化

常氧对照组、低氧模型组和黄芪复方灌胃组大鼠视网膜中MTH1 mRNA相对表达量分别为0.846±0.160、0.573±0.081和0.748±0.114，OGG1 mRNA相对表达量分别为1.013±0.168、0.772±0.136和0.807±0.734，组间总体比较差异均有统计学意义(F=24.511、12.692，均P<0.01)；其中低氧模型组MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相对表达量明显低于常氧对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；黄芪复方灌胃组视网膜MTH1 mRNA相对表达量明显高于低氧模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，OGG1 mRNA相对表达量与低氧模型组相比差异无统计学意义(P=0.743)(图3)。

图3 各组视网膜MTH1 mRNA和OGG1 mRNA相对表达量比较(单因素方差分析，Tamhane's T2检验，n=8) A：各组MTH1 mRNA相对表达量比较 F=24.511，P<0.01.与常氧对照组比较，aP<0.05；与低氧模型组比较，bP<0.05 B：各组OGG1 mRNA相对表达量比较 F=12.692，P<0.01。与常氧对照组比较，aP<0.05 MTH1∶ 8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶；OGG1:8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶Figure 3 Comparison of the expression of MTH1 and OGG1 mRNA in retina among different groups (One way ANOVA，Tamhane's T2 test,n=8) A：Comparison of the MTH1 mRNA expression F=24.511，P<0.01.Compared with the normal oxygen control group, aP<0.05；compared with the hypoxic model group，bP<0.05 B：Comparison of the OGG1 mRNA expression F=12.692,P<0.01.Compared with the normal oxygen control group, aP<0.05 MTH1：8-oxoguanine nucleoside triphosphatase；OGG1:8-hydroxyguanine glycolsylase

3 讨论

高海拔环境具有低气压和低氧分压的特点[5]。HAR属于急性高原病的一种，是机体处于高海拔环境时出现的视网膜出血、视盘水肿、棉絮斑和黄斑水肿[6]。作为中枢神经系统的延续，视网膜是人体最具代谢活性的组织之一，其血流量受组织氧张力的调控，过低的氧分压可诱导视网膜血流量增加，导致视网膜充血，甚至出血[7-8]。

本研究自拟的黄芪复方由黄芪、人参、枸杞、白术、玉竹、甘草组成，该复方药物在四君子汤的基础上，去除茯苓，增加黄芪、玉竹和枸杞。四君子汤能够改善组织抗氧化性，提高机体内分泌功能，调节体内能量代谢[9]，而黄芪、人参、枸杞、白术、玉竹、甘草对自由基清除率较高，有较强的抗氧化应激作用[10-15]。黄芪对免疫功能有着较广泛的影响，具有明显减少全身耗氧及增加组织耐缺氧2个方面的作用[10]。枸杞减缓脂质过氧化进程，具有良好抗氧化功能[12]。玉竹通过清除自由基，提高血清超氧化物歧化酶活力[14]。甘草对细胞有一定的保护作用，能抑制细胞凋亡，提高细胞抗氧化能力[15]。玉竹中的玉竹多糖在清除超氧阴离子及体外抗氧化方面明显优于茯苓多糖[16]，这为我们选择玉竹，去除四君子汤中的茯苓提供了依据。本课题前期研究结果已提示黄芪复方制剂可通过提高视网膜细胞线粒体锰超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶水平，降低细胞色素C活性来发挥保护视网膜功能的作用[17]。

本课题组前期研究表明，急性低压缺氧环境可导致大鼠视网膜损伤，其分子机制可能与调节缺氧相关因子和凋亡相关基因等的表达有关[18-19]。本研究中进一步探讨了急性缺氧对视网膜DNA相关因子的影响以及黄芪复方制剂对其防护的机制。本研究结果显示，在模拟海拔高度为5 km的低压缺氧条件下，大鼠视网膜组织出现水肿，p53蛋白表达增强。p53是一种转录因子，通过调控多个基因介导细胞死亡、衰老及DNA修复，具有保护生物体基因组的功能。在正常细胞内p53主要通过与E3泛素蛋白连接酶(mouse double minute 2homolog，MDm2)的负反馈调节来保持较低水平表达，在各种应激条件下，细胞通过抑制与MDm2的反应以及后续一系列调节因子来诱导p53的磷酸化和转录，使p53表达水平升高[20]。本研究中黄芪复方灌胃组视网膜p53表达水平较低氧模型组下降，提示黄芪复方使p53保持较低水平表达以减轻应激损伤而发挥视网膜保护作用。

双链断裂(double strand breaks，DSBs)是致命的DNA损伤形式之一[21]。而H2AX是DSBs最敏感的标志物，可用于检测DNA的损伤和修复[22]。H2AX在DSBs侧边位点被初始磷酸化后，可募集大量DSBs修复蛋白，实现对断裂位点的修复[23]。本研究结果表明低氧模型组视网膜中H2AX阳性染色较常氧对照组增强，其机制可能为急性缺氧环境下，通过碱基胺化、硝化和脂质过氧化作用影响信号传导，导致H2AX表达增强，破坏DNA，诱导氧化应激。黄芪复方灌胃组视网膜中H2AX的表达水平较低氧模型组明显降低，提示黄芪复方制剂可能是通过降低H2AX表达而减轻低压缺氧环境下视网膜DNA损伤。

在本研究中，模拟急性低压缺氧环境下大鼠视网膜中MTH1 mRNA和OGG1 mRNA表达水平明显降低，可能由于急性低压缺氧环境导致ROS攻击糖和碱基，造成DNA的氧化损伤。鸟嘌呤具有最低的氧化还原电位，是最易被氧化的DNA碱基，氧化后产生8-二氢鸟嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)[24]。OGG1从DNA中识别和切除8-oxoG，MTH1从核苷酸池中去除8-oxoG[25]，提示MTH1和OGG1在DNA完整性中具有重要作用。一项有关MTH1缺陷小鼠或细胞的研究表明，MTH1可有效减少小鼠大脑细胞核和线粒体DNA中8-oxoG的积累，从而有助于保护大脑免受氧化应激损伤[26]。本研究结果提示急性低压缺氧应激使大量的MTH1和OGG1用于清除8-oxoG，继而使大鼠视网膜中MTH1和OGG1减少，提示急性低压缺氧引起大鼠视网膜DNA损伤。而黄芪复方制剂上调了这2种基因的表达，说明该制剂对低氧诱导的视网膜DNA损伤有抑制作用。

利益冲突本研究中所有作者均声明不存在利益冲突