蛋白质组学分析在年龄相关性黄斑变性研究中的应用

杨帆 综述 孙晓东 审校

上海市第一人民医院眼科 国家眼部疾病临床医学研究中心 上海市眼底病重点实验室 上海眼视觉与光医学工程技术研究中心 上海市眼科疾病精准诊疗工程技术研究中心 200080

1 概述

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是造成全世界老年人群发生不可逆性盲的主要原因[1-2]。美国疾病控制和预防中心调查显示，目前有超过175万40岁及以上的美国人受到AMD的影响，预计这一数字到2020年将升至295万[3]。在亚洲，由于人口老龄化的影响，AMD的患病率将会在接下来的几十年中急剧增加[3]。早期AMD通常不伴随明显的临床表现，但眼底检查可以发现玻璃膜疣(drusen)的沉积和色素的改变，终末期表现为地图样萎缩和/或脉络膜新生血管的生成。新生血管性AMD(neovascular AMD，nAMD)，仅占AMD总数的10%，但其致盲患者数占AMD致盲总人数的90%[1]。AMD最大的风险因素是年龄的增长，除此之外，遗传变异和环境因素(特别是吸烟)也被证明为AMD的重要致病因素[4-9]，同时血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的病理性表达已经被证实为nAMD的重要致病机制之一[10]。抗VEGF治疗是nAMD的一线治疗方案，能够有效改善视网膜水肿并提高患者的视力；但随着治疗的延长，越来越多的患者表现出对药物的不敏感，甚至出现了病情的反复或加重[11-12]。因此，寻找到全新的治疗靶点显得更加必要和紧迫。

“蛋白质组学”一词是1995年从基因组学和蛋白质学的结合中创造出来的[13]。蛋白质组学包括对所有蛋白质的鉴定及其功能和结构的研究。蛋白质组学研究的一般工作流程包括样品选择、蛋白质提取、蛋白质或肽段的制备、蛋白质/肽段的分离、蛋白质/肽段的鉴定和定量，以及对所获得的定量数据的统计处理和使用生物信息学对结果的解释[14-15]。为了降低蛋白质组学研究的复杂性，一些细胞分区如“分泌组”(研究体液或细胞培养上清液中的分泌蛋白)、“细胞表面蛋白质组”、“磷酸化蛋白质组”和“相互作用组”(研究在细胞中发生的一系列蛋白质-蛋白质相互作用)等概念相继被提出[16]。临床蛋白质组学常用的定量方法为凝胶基聚丙烯酰胺凝胶电泳和二维差异凝胶电泳以及无凝胶同位素标记技术。无凝胶方法包括用于相对和绝对定量的同量异位标签，利用细胞培养物中的氨基酸进行稳定同位素标记以及无标记定量，其可以克服凝胶方法在分析低丰度、不溶性或大分子量蛋白质时繁琐且低效率等诸多缺点[17-18]。

近年来，蛋白质组学逐渐成为视觉科学研究工作的一部分，旨在提高对健康和疾病中眼功能的理解[19]。早期眼蛋白质组学研究重点是对眼特定成分中存在的离子和蛋白进行描述，随着技术的进步，研究方向开始转向带有生物功能的翻译后修饰[20]。2012年，人眼蛋白质组计划作为人类蛋白质组计划的一部分正式启动[21]。到目前为止，包括来自AMD患者或健康人的血浆、玻璃体、房水、视网膜、脉络膜、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞等多种组织和细胞的蛋白质组学数据已经得到较为全面的展示[22-25]。本文对蛋白质组学技术在AMD中的应用进展进行综述。

2 蛋白质组学在AMD中的应用

2.1 血液蛋白质组学分析

由于特殊的免疫背景及血-视网膜屏障的存在，眼部病变中蛋白种类和含量的变化很难通过血液体现出来，但由于血液标本更易获得且操作更加安全稳定，目前仍然存在基于血液标本的眼蛋白质组学研究。高丰度蛋白质一直是血液蛋白质组学分析的一个难点。

Xu等[26]利用比较蛋白质组学从26例AMD患者以及6位健康志愿者的血浆标本鉴定出28个有显著改变的蛋白，这些蛋白的生物功能包括免疫应答、细胞生长、决定细胞命运、伤口愈合和代谢等多个方面。Kim等[27]研究发现，膜相关蛋白纽蛋白为nAMD的潜在血浆生物标志物，且通过纽蛋白与AMD风险基因年龄相关性黄斑疾病易感性2(age-related maculopathy susceptibility 2，ARMS2)基因和补体因子H(complement factor H，CFH)基因的受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)曲线分析显示，纽蛋白结合基因建模能够对AMD进行更加精确地区分和诊断。Kim等[28]在后续的研究中还发现，与健康人相比，AMD患者血浆中磷脂转移蛋白和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶-1的表达量均有增加，且在晚期nAMD患者中增加更为明显，该2种蛋白与ARSM2和CFH基因类型组合建模同样增强对AMD的鉴别能力。Arya等[29]研究通过将具有CFH变体(T1277C)基因并同时视网膜下沉淀物中结合有球状羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)的个体与野生型以及单纯CFH基因突变个体的血浆进行对比，发现血液中6种蛋白的浓度受到CFH基因突变的影响，明确了遗传差异在视网膜下沉积物形成中的相关定性和定量信息。由于drusen等视网膜下沉积物的形成发生在AMD疾病过程的极早期，这个发现提示我们与HAP结合的关键蛋白可以减缓甚至防止drusen的形成，进而提供一种在疾病早期强有力的预防和治疗策略。以上这些研究结果证明对AMD患者的血浆进行蛋白质组学分析不仅能够找到疾病相关的生物标志物，还能将这些结果与基因型相结合提高对疾病的鉴别和诊断；另外对于疾病早期血液蛋白生物标志物的筛选，不仅能够加深我们对疾病相关机制的认识，甚至会可能改变AMD患者的诊断和治疗。

2.2 泪液蛋白质组学分析

泪液由泪腺、睑板腺、附属腺体和杯状细胞产生，覆盖在眼表面，起到保护、润滑和营养的作用[30]。由于泪液样本的获取容易且无创，泪液一直作为蛋白质组学研究各种眼部和全身疾病，如干眼症[31-32]，糖尿病[33]等的样本。

Winiarczyk等[34]对14例AMD患者和6例对照组患者的泪液进行蛋白质组学分析，共鉴定出了110种nAMD特异性表达蛋白以及97种干性AMD特异性表达蛋白。nAMD中的特异性表达蛋白主要参与吞噬作用、炎症、蛋白质水解的调节或者在细胞骨架功能中起关键作用，而在干性AMD特异性表达蛋白则主要参与氧化应激、炎症和蛋白水解等生物功能过程；该研究还发现10种热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)90相关蛋白在2种类型AMD泪液中高表达，其可能成为未来药物靶标的方向。另外，Winiarczyk等[34]在泪液中首次鉴定了8种与AMD疾病相关的新的蛋白，如SRC激酶信号传导抑制剂，Graves病载体蛋白和蛋白S100-A7A等。这些蛋白补充了对AMD发病机制的认识，也提供了该特定蛋白在AMD患者泪液中表达的证据。

2.3 房水蛋白质组学分析

房水是一种重要的眼内液体，负责向眼内无血管组织提供营养物质并带走代谢废物。房水蛋白水平在眼前后节疾病中均发生改变，表明房水蛋白可能在其发病机制中发挥作用[35-36]。与血清相比，房水中蛋白质浓度较低，为0.20～0.5 mg/ml，且存在一些高丰度蛋白如白蛋白、球蛋白和转铁蛋白等，这为房水蛋白质组学研究带来了新的挑战[37]。

Kim等[38]对nAMD患者房水进行全蛋白质组成分分析，鉴定出10种新的房水蛋白质，并发现nAMD患者房水蛋白主要参与急性期反应、补体系统和凝血系统等信号通路；通过筛选潜在的生物标志物发现，与对照组相比，nAMD患者房水中转化生长因子-β诱导蛋白ig-h3、血浆蛋白酶C1抑制剂和血浆铜蓝蛋白有着更高的相对丰度且可以作为疾病的生物标志物和治疗的靶点。Yao等[39]检测并对比了6例nAMD和6例白内障患者房水中蛋白的组成，发现差异表达的蛋白主要与炎症、细胞凋亡、血管生成和氧化应激有关，其中nAMD患者房水中载脂蛋白-1的表达量显著增加，该蛋白是潜在的脂质过氧化产物的清除剂，其可能在nAMD中起到保护作用。

除了对房水中所有蛋白质成分及表达水平变化的研究外，还有一些研究重点关注了房水中某些特定的蛋白群体。有证据表明泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)的抑制会导致RPE细胞中毒性蛋白和炎性成分的积累，Lee等[40]对nAMD患者和对照者的房水进行蛋白质组学的分析后，鉴定出了6种UPS相关蛋白，包括26S蛋白酶体非三磷酸腺苷酶调节亚基1(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 r，Rpn2)在内的4种蛋白在AMD患者房水中含量较高，其中Rpn2的表达量在治疗前、后均高于对照组，提示该蛋白可能为nAMD的生物标志物。Kang等[41]收集nAMD患者抗VEGF治疗前及治疗后房水，对其中外泌体蛋白的分析结果显示，在nAMD患者的房水中有6种蛋白表达增加，其中细胞角蛋白8在ROC曲线分析中表现最好，但其是否为生物标志物还需要进一步验证。随后Park等[42]研究证明了nAMD患者房水中Wnt抑制因子-1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)和Dickkopf相关蛋白3表达上调，且WIF-1与视网膜结构损伤的情况相关，首次将蛋白与疾病的解剖学和表型进行联系，使得被鉴定到的蛋白不仅可以作为疾病诊断的生物标志物，还能作为疾病进展程度及预后情况的预测分子。

Baek等[43]对干性AMD患者的房水标本进行了去除高丰度蛋白后的全蛋白质组学分析，共定量到119个房水蛋白，有3个蛋白之前并未发现在drusen中存在或与干性AMD有联系，其中上调的Lumican蛋白和角膜蛋白多糖(Keratocan)均与细胞外基质的调节相关。

以上对于AMD患者房水样本的蛋白质组学分析表明房水中某种或某类特定蛋白的表达能够受到疾病的影响，这些变化不仅仅局限于对新生血管的调节，还与氧化应激、免疫调节等方面有很大的相关性。房水生物标志物的筛选除了应用于疾病诊断外，还在疾病分级和预后判断上起到重要作用。

2.4 玻璃体液蛋白质组学分析

眼内液体包括房水和玻璃体液。从解剖学角度来讲，玻璃体液与视网膜、RPE细胞等眼底组织和细胞的距离较房水更近，理论上更能直接地体现出眼底病变时对蛋白质的影响。

Koss等[44]应用毛细管电泳结合质谱分析73例初次接受治疗的nAMD患者及15例特发性玻璃体混浊患者的玻璃体液样本并鉴定AMD的潜在蛋白标记物，发现nAMD患者的玻璃体液中19种蛋白质上调，这些蛋白多由血浆衍生，参与生物(离子)转运、急性期炎症反应和血液凝固过程；对随机选择的5种蛋白质进行验证显示α-1-抗胰蛋白酶为AMD的潜在蛋白标记物。Nobl等[45]在132例nAMD患者玻璃体液标本中鉴定出101种差异表达蛋白质，使用严格的统计分析并实施封闭测试程序后筛选出候选生物标志物后，后续ELISA验证结果显示丛集素蛋白和色素上皮衍生因子在nAMD患者玻璃体液中显著增加。

除了横向探究AMD患者璃体液标本中的生物标志物外，Ecker等[46]首次完成了连续监测nAMD患者玻璃体液蛋白质组变化的前瞻性研究；该研究利用反相蛋白质微阵列技术测量了标本中37种蛋白质的表达水平，并将其变化与视网膜下水肿(subretinal fluid，SRF)厚度进行相关性分析，发现基质金属蛋白酶9水平随SRF厚度的变化而发生改变，这为继续探究nAMD病情变化的相关分子机制提供了基础。

由于样本采集的特殊性，目前对于AMD患者玻璃体样本的研究数量较少且主要集中于nAMD人群。在以上3个研究中，研究者们通过对比找到了nAMD的生物标志物，并完成了对玻璃体内蛋白质变化情况的监测，这使得疾病中的某一病理特征与特定蛋白表达水平相联系，有助于实现精准治疗。

2.5 视网膜和脉络膜蛋白质组学分析

视网膜的不同区域在分子构成上是有差异的，分别发挥着独特的功能并体现出对疾病的不同易感性。对这些区域和层次中每一个部分进行单独的蛋白质组学分析可以提供对疾病机制的多角度见解，包括AMD、糖尿病和青光眼等。因此在进行蛋白质组学分析之前，对视网膜进行区域和层次的分离是必要的[47-48]。而作为受AMD疾病影响最大的眼底组织，脉络膜的蛋白质组学分析更能精准地体现不同阶段及不同类型AMD的分子机制。

Ethen等[49]将从人AMD供体上获得的视网膜样本按照黄斑视网膜和周边视网膜分别进行蛋白质组学分析并按照疾病进展分为4期，研究发现共有26种蛋白的表达水平随着疾病严重程度的改变发生变化，其中参与微管调节的蛋白在AMD发病的早期发挥作用，包括微管蛋白、prefoldin-1、T-复合多肽1、共因子a和微管不稳定蛋白；同时该研究还发现虽然黄斑区与周边区视网膜有超过一半的蛋白表达存在差异，但是两个区域仍有40%的蛋白变化一致，表明AMD引起的病理变化涉及到全视网膜而不仅仅局限于黄斑部位。同样的，Yuan等[50]将获得的AMD患者及健康对照者去世后捐献Bruch膜/脉络膜复合体的样本按照疾病的不同阶段进行分类，在鉴定出的901种蛋白质中，大多数蛋白在AMD和对照样品之间的差异很小，而根据疾病进展的不同进行分析显示升高的蛋白中大约60%参与免疫反应和宿主防御过程；同时该研究结果显示，RPE65、细胞视黄酸结合蛋白1(cellular retinoic acid-binding protein 1，CRABP1)、细胞视黄醛结合蛋白以及视黄酸受体间结合蛋白这4种视黄酸加工蛋白表达仅在早/中期AMD患者Bruch膜/脉络膜复合体中升高，表明这些蛋白在AMD发病起始中发挥作用；而晚期糖基化终产物受体半乳糖凝集素3表达在晚期干性AMD患者Bruch膜/脉络膜复合体中升高明显，提示晚期糖基化终产物在干性AMD进展中发挥作用。以上这些结果均证实了不同阶段和不同类型的AMD涉及的蛋白及分子途径不同。

Sohn等[51]使用双向电泳和/或质谱法来评估114只人眼脉络膜-RPE复合体薄、厚脉络膜间的蛋白差异，在较厚的脉络膜中丝氨酸蛋白酶SERPINA3水平较高，而在薄的脉络膜中金属蛋白酶组织抑制剂-3表达水平较高。这种蛋白酶和蛋白酶抑制剂之间的失衡不仅有利于我们更好理解脉络膜变薄的相关机制，同时还能指导开发AMD新疗法。

综上，就目前的研究而言，对于AMD患者视网膜和脉络膜组织的蛋白质组学分析大多根据解剖结构和疾病分期来分类，尽管这可能损失掉部分对某一特定类型AMD的分析结果，但这样的分析方法与很多临床上对于疾病的研究相一致，这使得蛋白质组学数据能与临床数据相匹配并在一定程度上支撑和解释临床相关结果。

2.6 Drusen蛋白质组学分析

无论遗传和环境因素如何，AMD患者早期的一个关键的表现是drusen的形成，这种包含脂质和炎性废物的细胞外沉积物随着年龄的增长积聚在RPE下方Bruch膜上，但drusen形成的具体分子机制尚未明确[19]。

Crabb等[52]开发了一种分离微克量级drusen和Bruch膜的方法用于蛋白质组分析，结果显示在AMD患者的drusen中晶状体蛋白更常见，此外还发现蛋白质的氧化修饰在AMD的发病机制中起到了关键作用。这些结果与在动物实验中的发现保持一致[53]。

2.7 RPE细胞蛋白质组学分析

RPE细胞是血-视网膜屏障的关键组成部分，且是人体中具有最高吞噬活性的细胞，能通过吞噬并回收光感受器外节来维持视网膜的健康，因此RPE细胞发生功能障碍或死亡可导致光感受器细胞的减少，对AMD的发生及发展起到了十分关键的影响[19]。早期一系列重要的围绕RPE细胞展开的蛋白质组学研究大多以脂褐素为中心，脂褐素是一种由不同类别生物分子混合在一起的复杂混合物，且其中许多成分都存在氧化修饰[19]。由于脂褐素与AMD密切相关，阐明其详细分子组成对于理解AMD具有十分重要的意义。

有研究检测并对比了视网膜脂褐素和黑色素脂褐素的蛋白组成，证实了人脂褐素蛋白中氧化修饰的存在，同时发现了2者存在来源的差异[54-55]。然而在Ng等[56]研究却发现，从RPE中分离出的脂褐素颗粒虽然存在蛋白质氧化修饰，但所占比例很小，这暗示着脂褐素致病机制可能并不依赖于相关蛋白质氧化修饰来发挥作用。

Nordgaard等[57]对来自AMD患者供体的原代RPE细胞进行了全蛋白质组学分析，通过比较四个阶段AMD的RPE蛋白质组成，鉴定出早期疾病阶段的蛋白标志物，包括Hsp(如Hsp70等)和凋亡信号通路(如αA晶状体蛋白等)的成分，其中一些蛋白与线粒体功能相关，晚期AMD衍生的RPE细胞显示蛋白质的变化与类视黄醇相关功能的扰动有关，如CRABP1表达水平的改变。基于此研究结果，该团队使用相同的方法学策略专注于探究RPE细胞中的线粒体蛋白质组，结果显示，线粒体翻译和延伸所必需的线粒体延伸因子Tu在早期AMD阶段RPE细胞中过表达，ATP合酶复合物的几个亚基在3期和4期AMD的RPE细胞中的表达水平降低，参与核编码蛋白质向线粒体的转运的线粒体热休克蛋白70在晚期AMD阶段RPE细胞中表达降低，这些均表明在AMD的整个阶段中均存在线粒体功能障碍，具体机制可能与线粒体翻译，核编码蛋白导入和ATP合成酶活性的改变有关[58]。

除了探讨RPE细胞本身及其内部成分，An等[59]对来自于AMD供体和原代RPE细胞的分泌蛋白组进行了分析，发现RPE细胞分泌多种细胞外基质蛋白，补体因子和蛋白酶抑制剂，2个组间差异蛋白主要参与组织发育、血管生成以及补体调节和蛋白质聚集。在后续的研究中，该团队还发现在AMD的发病机制中，高温必需蛋白A1(high temperature requirement A1，HTRA1)与补体调节和淀粉样蛋白沉积之间存在关联[60]。

这些研究的结论与前文所述其他样本来源研究在整体上并无明显差异，对于AMD疾病的蛋白质组学研究从人体组织或液体过渡到细胞层面使得我们在实验室开展相关蛋白验证和疾病机制的探索变得更加直接。

3 蛋白质组学在AMD应用中面临的挑战和前景展望

作为nAMD的一线治疗方案，尽管抗VEGF疗法已经取得了突出的成绩，但仍有约10%的患者并不能从中受益，且大量研究显示这可能与特定的遗传学因素相关，主要包括VEGF相关基因、补体相关基因、白细胞介素相关基因、ARMS2和HTRA1等[61]。在过去的十年中，遗传学被认为是AMD发展的一个重要危险因素。然而，最近的一项有史以来最大样本量队列研究表明，即使纳入19个基因位点对AMD进行预测，结果依然显示遗传因素对AMD进行预测的准确性较低[62]。因此，使用蛋白作为生物标志物或许可以对疾病的发生和发展起到更好的预测作用，且目前研究显示将蛋白质组学与基因结果相结合的分析方法能够在疾病的诊断中表现得更为突出。目前利用蛋白质组学对AMD进行研究发现，差异蛋白主要集中于患者可能存在的氧化应激、炎症、补体、细胞外基质调节等过程的紊乱，这提示我们可以将疾病治疗的方向转向这些方面来应对部分患者出现的抗VEGF治疗无应答的情况。然而目前对出现抗VEGF治疗无应答患者生物标志物的鉴定和相关机制的研究仍处于起步阶段，我们课题组正在对有疗效差异的两组患者房水标本进行蛋白质组学检测，尽管现在尚未得到确切的结论，但我相信通过我们的研究能够帮助大家加深对疾病以及治疗抵抗相关机制的理解和认识，同时提供在AMD疾病的预防、诊断和治疗过程中的新思路。值得注意的是，蛋白质组学在眼部疾病的应用中也具有局限性，如，眼部组织获取的风险高，获取样本的量也相对较少等。另外，膜蛋白和低丰度蛋白质的分析也是眼部蛋白质组学研究的主要限制。与其他学科的研究一样，眼科蛋白质组学不仅仅局限于疾病中差异表达蛋白的筛选，接下来的一项主要任务是尝试对蛋白质进行功能学鉴定，这包括对蛋白质相互作用和反应以后修饰的研究。未来应用于AMD的蛋白质组学研究不仅要克服以上困难，还应注重治疗前后发生的蛋白分子变化[63]以及扩大样本量，总结现有研究并开辟新的研究方向。

总之，尽管蛋白质组学在AMD中的应用面临着不小的挑战，但是由于其对疾病宏观认识的支持以及深入探索疾病相关机制的巨大潜力，该项技术在AMD和其他眼部疾病中具有广阔的应用空间。

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