印第安纳沙门菌环介导等温扩增检测方法的建立

龚建森，徐敬潇，付立霞，张 笛，董永毅，徐 步，窦新红*

(1.中国农业科学院家禽研究所，扬州 225125；2.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；3.江苏省动物疫病预防控制中心，南京 210036)

沙门菌是重要的人畜共患病原菌，可造成严重的经济损失与食品安全问题。沙门菌血清型繁多，其中，广受关注的是临床分离率高的血清型，如肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌[1]。但在特定地区或年代，某些原本罕见的血清型也可发展成流行血清型[2]。印第安纳沙门菌(S.Indiana)早期报道罕见，但近年来在国内报道频率呈显著上升趋势，在养殖、食品和环境中具有较高流行率，引起畜禽养殖、食品安全、公共卫生等领域的高度关注[3-5]。

目前，对S.Indiana的检测均基于传统细菌学检测方法，过程繁琐费时，不能满足及时发现病原、控制传播途经，消除污染源的疫病防控要求。此外对S.Indiana血清学检测需鉴定O抗原和H抗原，对于 “自凝菌株”或“鞭毛发育不良菌株”等不能进行有效检测，造成假阴性结果[6]。随着科技发展，以分子生物学为基础的病原检测方法在实践检验中不断取得新进展，以其敏感特异、简便快速的特点成为最具潜力的检测方法。目前，已成功报道的分子生物学检测方法涉及肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌等多个血清型[7]。S.Indiana因其广泛流行与高度耐药的特性已受到多个研究领域的高度关注，特别是S.Indiana已普遍对WHO推荐治疗系统性沙门菌感染[9]的环丙沙星和头孢曲松产生耐药。鉴于此，有必要建立一种快速、灵敏、特异、简便的方法用于临床样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

39株参考菌株(31株沙门菌，8株非沙门菌)和359株分离株均由中国农业科学院家禽研究所保存并提供。Bst酶购自NEB公司；PrimeStarHS高保真酶、rTaq酶、pMD19、BstB Ⅰ、BamHⅠ购自TaKaRa公司；钙黄绿素购自Sigma公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 检测靶点筛选与引物设计 通过BLAST程序将已公布的S.Indiana C629株全基因组序列(NZ_CP015724.1)中4 739个基因与其他已知基因进行比对，利用比较基因组学方法筛选特异基因。通过在线软件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP引物组。

1.2.2 反应体系建立 以S.Indiana ATCC51959基因组为模板进行体系优化。采用25 μL反应体系，分别对Bst酶、Mg2+、dNTPs、内引物、反应温度、反应时间进行单因素优化。

1.2.3 反应产物鉴定 扩增产物使用BstB I消化，在20 μL体系中加入5 μL 的LAMP产物、1 μLBstBⅠ、2 μL 10×L Buffer，37 ℃酶切3 h。同时，以BamHⅠ为对照。酶切产物使用2%凝胶电泳分析，产物回收测序后经BLAST验证。

1.2.4 特异性验证 以39株参考菌株基因组模板，使用优化后的LAMP体系进行特异性试验。

1.2.5 灵敏度测试 使用pMD19载体构建含靶标的标准质粒。测定质粒起始浓度后，以10倍比稀释的质粒为模板，分别按已建立LAMP方法和常规PCR方法(使用F3和B3为引物)进行敏感性试验。PCR体系：12.5 μL 2×TaqDNA聚合酶预混液，5 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水适量。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共计35个循环，72 ℃终延伸5 min。反应产物使用2%凝胶电泳检测。

1.2.6 可视化反应 配制含1.25 mmol·L-1钙黄绿素与15 mmol·L-1氯化锰荧光指示剂，反应前，加入1 μL，反应后，通过溶液颜色变化或荧光强弱判断是否发生反应。

1.2.7 防污染LAMP体系的建立 使用UDG与dUTP系统建立防污染LAMP体系[8]，即向反应体系中加入0.35 μL的100 mmol·L-1dUTP进行反应。将含dUTP和普通LAMP扩增产物稀释至103、106、109倍，以稀释后的产物为模板再进行LAMP反应，其中，含dUTP的模板先用0.25 U的UDG于37 ℃预处理10 min，常规LAMP产物不做处理。

1.2.8 临床分离菌株检测 使用LAMP可视化判定方法检测359株临床分离细菌，设立阳性与阴性对照。同时参考GB4789.4—2016标准中方法，将检测结果进行比较。

2 结 果

2.1 检测靶点筛选

根据比较基因组学筛选结果，共鉴定出6个特异性候选基因。通过初步试验后，确定A7P63_09100基因为LAMP检测靶点，通过在线软件设计LAMP检测引物组(表1)。

表1 LAMP反应引物组

2.2 反应体系的建立

根据反应条件优化结果，确定25 μL反应体系：1 μLBst酶、3 μL dNTPs、2 μL Mg2+、5 μmol·L-1外引物各1 μL、40 μmol·L-1内引物各0.75 μL、2 μL模板、2.5 μL 10×Buffer和11 μL ddH2O。反应条件为64 ℃扩增50 min，80 ℃灭活10 min。扩增产物经2%琼脂糖电泳可见LAMP反应典型的阶梯状条带(图1)。

M.DL5000 DNA相对分子质量标准；1.LAMP产物；2.BstBⅠ酶切产物；3.BamHⅠ酶切产物；4.阴性对照

2.3 酶切鉴定

酶切结果表明，该LAMP产物可以被BstBⅠ消化，而不能被BamHⅠ消化(图1)。产物回收测序，将结果(MT329629)进行BLAST验证，相似性达100%。

2.4 特异性验证

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，仅S.Indiana ATCC51959菌株出现典型的阶梯状条带，其余菌株均为阴性。

2.5 灵敏度测试

经拷贝数计算，质粒初始拷贝数为2.95×105拷贝·μL-1。检测结果表明，LAMP方法可检出5.9×101拷贝·反应-1，而PCR方法为5.9×102拷贝·反应-1。

2.6 可视化反应

阳性样品在可见光下呈绿色，阴性样品呈橘黄色；在紫外线下，阳性管可激发明亮荧光，而阴性管未见荧光，表明可通过钙黄绿素实现可视化判定。

2.7 防污染试验

使用UDG-dUTP系统的反应体系未见扩增条带，表明该系统可有效避免气溶胶污染，而未使用UDG-dUTP系统的反应体系仍检测出稀释109倍的产物。

2.8 分离菌检测

359株分离菌(自凝株6株)使用细菌学方法共鉴定出158株沙门菌(自凝株3株)。使用LAMP方法对155株非自凝沙门菌分型，结果(表2)表明，64株为S.Indiana，与血清学结果一致。而3株沙门菌自凝株中有1株LAMP反应阳性，对该阳性菌株测序结果表明其为S.Indiana。

表2 临床分离菌检测结果

3 讨 论

LAMP是一种高效核酸分子等温扩增技术，已在病原微生物检测领域得到广泛应用[10]。该方法不需要昂贵的反应设备，适合现场检测等优势。本研究通过比较基因组学成功筛选出S.Indiana特异性基因序列，并以此为靶标建立了特异性LAMP检测方法。试验表明，该方法具有较好的特异性，其检测下限为59拷贝·反应-1，优于PCR方法，反应结果通过肉眼即可判断，避免因开盖造成的污染问题。同时本方法可在1 h内完成样品检测，显著优于传统检测方法。用建立的方法对临床分离菌株进行检测，结果不仅与国家标准一致，还可用于自凝菌株检测。上述结果表明，本研究建立的S.Indiana-LAMP方法具有快速简便、灵敏特异的特点，非常适合临床快速检测，为S.Indiana的科学防控提供一种检测工具。

4 结 论

本研究建立的LAMP检测方法能实现印第安纳沙门菌的快速检测，对临床分离菌株进行检测，结果不仅与国家标准(GB4789.4—2016)检测结果一致，还可用于自凝菌株检测。