老年重症肺炎患者血清中活化蛋白C、髓样分化因子88水平与不良预后的关系

唐先俊 姚欣

重症肺炎是临床常见的一种由呼吸道感染引发的严重疾病，其发病迅速，可伴有呼吸衰竭、低氧血症、低血压等症状，在老年人发病中病死率高、预后差，对老年患者生命安全构成极大威胁[1]。活化蛋白C(activated protein C，APC)是胰岛素样丝氨酸蛋白酶家族成员，可调控化学趋化因子、炎性因子及细胞因子的释放，在多种炎症疾病中表达失调[2]。曹雪涛等[3]研究显示外周血APC水平在经乌司他丁治疗的重症肺炎婴幼儿中明显升高，可能参与并影响重症肺炎的发展进程。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll/IL-1R家族成员之一，广泛存在于多种细胞和组织中，表达升高可促进炎性反应[4]。MyD88在重症肺炎支原体肺炎患儿血清中表达升高，其可能在重症肺炎支原体肺炎中发挥重要作用[5]。基于此，本研究通过观察APC、MyD88在老年重症肺炎患者血清中的水平，并分析两者与不良预后的关系，以期为动态监控并预后评估老年重症肺炎提供临床参考凭据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2017年4月至2018年10月我院收治的老年重症肺炎患者60例为患病组，其中男32例，女28例；年龄65～80岁，平均年龄(72.47±6.27)岁。选择同期健康体检者57例为健康组，其中男29例，女28例；年龄66～79岁，平均年龄(72.28±6.11)岁。2组性别比、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究方法符合伦理学规定，经医院伦理委员会审核批准。

1.2 标准

1.2.1 重症肺炎诊断标准：依照《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》中的相关判定标准[6]。

1.2.2 纳入标准：①符合重症肺炎诊断标准者；②患者年龄均≥65岁；③生理病理资料完整者；④所有患者或者其家属签署知情同意书。

1.2.3 排除标准：①入院时即发生急性心力衰竭、严重的肝肾功能不全、慢阻肺者；②合并自身免疫系统疾病、肿瘤者；③合并血小板降低、严重凝血功能障碍、活动性出血、颅内出血者；④近期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝药者。

1.3 评分标准与预后情况 (1)急性生理学和慢性健康状况Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)评分标准[7]：常作为判断重症加强治疗病房(intensive care unit，ICU)患者病情及预后评估的指标，评分范围0～71分。包含急性生理学评分(APS)、慢性健康评分、年龄评分三部分，最终评分是以上三项评分总和，以APACHEⅡ>15分表示重症，其分值越高，患者病情越严重。(2)预后情况：对60例老年重症肺炎患者进行28 d随访，以患者出院病情转归或转出ICU情况为存活组(39例)、死亡组(21例)。

1.4 主要试剂 TRIzol RNA提取试剂(货号：5007050)购买于上海酶研生物科技有限公司，cDNA第一链合成试剂盒(货号：WE0132-EOK)购买于北京百奥莱博科技有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(货号：HY-K0501)购买于美国Med Chem Express LLC公司；人APC酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)试剂盒(货号：CSB-E09909h-1)购买于上海振誉生物科技有限公司，人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)ELISA试剂盒(货号：QN-PS0122)购买于上海乔羽生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 标本采集及预处理:收集患病组确诊当天、健康体检者当日清晨空腹外周血约4 ml，室温下静置约35 min，于4℃以12 000 g离心12 min，收集上层血清，分装于1.5 ml冻存管中，于-80℃环境中保存，待测。

1.5.2 ELISA法检测血清APC、TNF-α水平:美国Thermo K3(30000)全自动多功能酶标仪检测2组受试者血清APC、TNF-α水平，具体检测步骤参照相关试剂盒说明书。

1.5.3 实时荧光定量法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测2组血清MyD88水平:取出保存于-80℃环境中的血清样本，冰上解冻，加适量TRIzol裂解样本，此次加氯仿、异丙醇、70%乙醇提取样本的总RNA，以0.1% DEPC溶解总RNA，作为逆转录的模板。依照qRT-PCR反转录试剂盒cDNA第一链合成试剂盒操作步骤及注意事项配制逆转录反应体系，将样本总RNA反转录成cDNA。qRT-PCR扩增检测采用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒，反应体系配制按照其说明书进行。待测MyD88及内参分别设置3个复孔进行半定量检测。MyD88以β-actin为内参，其对应引物序列见表1，其相对表达量以2-ΔΔCT计算。见表1。

表1 MyD88及内参β-actin引物序列

2 结果

2.1 2组血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ评分情况 与健康组比较，患病组患者血清APC水平明显降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。患病组患者的APACHEⅡ评分为(22.12±3.77)分。见表2。

表2 2组血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ评分比较

2.2 2组不同预后老年重症肺炎患者血清APC、MyD88水平和APACHEⅡ评分比较 与存活组比较，死亡组患者血清APC水平明显降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ评分明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组不同预后老年重症肺炎患者相关指标比较

2.3 老年重症肺炎患者血清APC、MyD88水平与TNF-α、APACHEⅡ评分的关系 Pearson相关性分析结果显示，老年重症肺炎患者血清APC与TNF-α水平、APACHEⅡ评分呈负相关(r=-0.412、-0.458，P<0.05)，MyD88与TNF-α水平、APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.356、0.525，P<0.05)。见表4。

表4 老年重症肺炎患者血清APC、MyD88水平与TNF-α、APACHEⅡ评分的关系

2.4 Logistic回归分析老年重症肺炎预后的影响因素 以老年重症肺炎预后为因变量，以血清TNF-α、APACHEⅡ评分、APC、MyD88为自变量，行Logistic回归分析，结果显示TNF-α、APACHEⅡ评分、MyD88为老年重症肺炎预后的危险因素(P<0.05)，APC为老年重症肺炎预后的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响老年重症肺炎预后的Logistic回归分析

2.5 血清APC、MyD88对老年重症肺炎患者预后的诊断价值 ROC曲线显示，血清APC水平预测老年重症肺炎患者不良预后的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.873(95%CI:0.786,0.960)，截断值为28.65 pmol/L，此时其灵敏度、特异度分别为85.7%、71.8%；血清MyD88水平预测老年重症肺炎患者不良预后的AUC为0.781(95%CI:0.683,0.910)，截断值为1.98 pmol/L，此时其灵敏度、特异度分别为71.4%、84.6%；血清APC、MyD88水平预测老年重症肺炎患者不良预后的AUC为0.918(95%CI:0.840,0.997)，其灵敏度、特异度分别为94.2%、80.5%。见图1。

图1 血清APC、MyD88对老年重症肺炎患者不良预后的ROC评价

3 讨论

重症肺炎多是感染特殊病原微生物引起肺部损伤的危重症疾病，其发生时伴有大量炎性因子入血、电解质紊乱、脑水肿、脓毒症等并发症，病情危重且预后较差，尤其老年人[8]。因此，寻找合理评估重症肺炎预后指标对患者病情准确评估和改善患者预后具有重要指导意义。

APC是由各种因素刺激蛋白C形成12个氨基酸构成的活性多肽，在胞内信号传递、抗凝、抗凋亡、活化内皮细胞屏障等过程中发挥重要调节作用[9]。APC在类风湿性关节炎疾病中表达失调，其可能在类风湿性关节炎炎症过程中发挥作用[10]。APC在脂多糖诱导的肺损伤中异常表达，其可调节TNF-α、白介素-6等炎性细胞因子，进而影响肺部炎症程度[11]。以上研究表明APC在炎症类疾病过程中表达异常。本研究显示，患病组老年重症肺炎患者血清APC水平明显低于健康组，提示APC在老年重症肺炎疾病进展中起到一定作用。MyD88广泛分布于肝、脾、肾、肌肉等组织及免疫细胞中，是重要信号传导分子，可影响机体防御蛋白及细胞因子的转录及表达，从而调节免疫炎性反应[12]。MyD88在经通络开痹片辅助治疗的类风湿关节炎患者中表达下调，其可能在炎性反应过程中发挥一定作用[13]。MyD88在Cm呼吸道感染的肺组织中高表达，其可能影响炎性反应进程[14]。本研究中血清MyD88水平明显高于健康组，提示MyD88可能影响老年重症肺炎的发生与发展。

TNF-α在重症肺炎患者血浆中的水平明显升高，其可作为诊治重症肺炎的辅助指标[15]。APACHEⅡ评分广泛应用于危重疾病患者的病情严重程度及预后情况评估，是老年重症肺炎的预后影响因素[16]。本研究中老年重症肺炎患者血清TNF-α水平、APACHEⅡ评分明显高于健康组，提示老年重症肺炎与细胞炎性因子、APACHEⅡ评分密切相关。本研究中死亡组老年重症肺炎患者血清APC水平明显低于存活组，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ评分明显明显高于存活组，提示监测血清APC、MyD88、TNF-α水平及APACHEⅡ评分，对评估老年重症患者预后有一定的参考价值。

本研究中老年重症肺炎患者血清APC与TNF-α水平、APACHEⅡ评分呈负相关，MyD88与TNF-α水平、APACHEⅡ评分呈正相关，提示APC、MyD88可能与TNF-α、APACHEⅡ相互影响，从而共同作用于老年重症肺炎的发病进程。进一步研究发现TNF-α、APACHEⅡ评分、MyD88为老年重症肺炎预后的危险因素，APC为老年重症肺炎预后的保护因素，提示升高TNF-α、APACHEⅡ评分、MyD88水平，降低APC水平，均会增加老年重症肺炎患病几率，对TNF-α、APC、MyD88水平及时监测，并对患者进行APACHEⅡ评分，有助于及早判定并控制老年重症肺炎的病情进展。血清APC、MyD88水平对老年重症肺炎患者预后的预测AUC分别为0.873、0.781，当血清APC含量低于28.65 pmol/L或MyD88表达水平高于1.98，老年重症肺炎不良预后几率较高，提示血清APC、MyD88对老年重症肺炎预后有一定诊断价值，血清APC、MyD88联合诊断老年重症肺炎不良预后的AUC为0.918，其灵敏度94.2%，特异度为80.5%，提示APC、MyD88联合诊断老年重症肺炎不良预后的价值高于单独诊断，两者联合可提高老年重症肺炎不良预后的诊断效能。

综上所述，老年重症肺炎患者血清APC水平降低，MyD88表达上调，APC和MyD88可能参与老年重症肺炎的发生发展过程，APC和MyD88联合可提高老年重症肺炎预后的诊断价值，具有一定参考价值。