鸡源和兔源屎肠球菌的耐药性及相关基因分析

赵巧雅　路晓　高月花　刘娜　胡峰　刘玉山　刘小群　黄兵

摘  要：2020年4月，山东省某鸽场及某兔场发生腹泻情况，发病率较高。试验从病鸽及病兔肝脏中各分离到一株革兰氏阳性球菌，通过16S rRNA测序鉴定均为屎肠球菌。两株分离菌均未检测到cylA、gelE、ace等8种毒力基因。药敏试验和耐药基因结果显示，两个菌株都对β-内酰胺类耐药，耐药基因检测结果也一致。这些结果提示屎肠球菌或许能引起鸽及兔感染，对鸽或兔的临床治疗及公共卫生学具有一定的参考意义。

关键词：屎肠球菌;分离鉴定;耐药;毒力基因

中图分类号：S858.31    文献标识码：B    文章编号：1673-1085（2021）1-0005-04

屎肠球菌（Enterococcus faecium）属肠球菌属中的一类，是人及动物的肠道正常菌群之一[1，2]，其代谢产物能够抑制肠系有害菌[3]、调节肠道菌群结构、改善生产性能等[4]，常作为饲料添加剂在养殖生产中普遍应用[5];同时也是重要的人兽共患条件致病菌，可引起人及动物的感染等[6]，且可通过污染的食物传播给人[7]，在公共卫生学上具有重要意义，因此在生产中应严格筛选菌种。

2020年4月，山东省某鸽场鸽子零星出现精神沉郁、水样腹泻，一周内死亡。同期，某兔场仔兔也发生腹泻情况。本研究以发病鸽和发病仔兔为研究对象，分别无菌采集肝脏进行分菌，通过纯化、16S rDNA测序、生化试驗、药物敏感性试验等完成菌种鉴定，利用耐药基因检测分析分离菌的耐药性，为临床治疗及公共卫生提供参考。

1  材料

1.1  病料来源  病料来源于发病鸽场与兔场。

1.2  试剂  2000 DNA Maker购自天根生化科技;pMD-18T克隆载体购自TaKaRa公司;PCR扩增试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司;细菌微量生化管购自北京陆桥技术股份有限公司;药敏纸片购自北京艾博利德商贸有限公司;甘油、1×TE缓冲液、细菌培养基及其他试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2  方法

2.1  细菌分离纯化  无菌条件下分别取病鸽及病兔肝脏，接种于5%胎牛血清培养基，37 ℃培养18～24 h，观察记录细菌生长状况及形态。挑取培养或纯化后的单菌落，涂片进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态及染色特性。

2.2  生化试验  参照伯杰氏手册，使用杭州滨和微生物试剂有限公司的细菌微量生化管，按使用说明书进行操作及结果判定。

2.3  PCR鉴定  16S rRNA基因片段通用引物，27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取单个细菌菌落悬浮于50 μL生理盐水作为模板，按照如下比例配制反应体系：模板1 μL，上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，补充去离子水至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。将PCR产物克隆至pMD-18T 载体，鉴定阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.4  药敏试验  按照WHO推荐的琼脂纸片扩散法（K-B）对分离菌进行药敏检验，结果按NCCLS标准做出判定。

2.5  耐药基因及毒力基因检测  11种耐药基因[8][（VanA、VanB、qnrA、tetE、flo R、aac（6'）-I、tet M、erm B、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）]和8种毒力基因（cylA、gelE、ace、agg、esp、efaA、acm、fsr）引物序列参照文献[9，10]合成。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与GenBank序列比对。

3  结果与分析

3.1  细菌分离情况  从病鸽、病兔中各分离出1株细菌，分别命名为G0401、T0402，2株分离菌在有氧和微厌氧的条件下均可生长，37 ℃培养18～24 h，在血清板上呈现灰白色半透明、圆形微凸、表面光滑、湿润的小菌落，菌落大小在0.5～2.0 mm之间。1000×镜检为单个、成对或短链状的G+球菌。

3.2  生化试验  两株分离菌均能发酵木糖、蔗糖，均能水解精氨酸，不发酵山梨醇、甘露醇，不液化明胶，均符合肠球菌生化特性。

3.3  16S rDNA的测序结果及同源性分析  PCR扩增结果显示，两株分离菌扩增序列大小约为1500 bp的目的条带;鸽源、兔源分离株扩增序列测序后与NCBI公布的登录号为CP044264.1参考序列同源性分别达99.67%、99.74%，两株分离菌鉴定为屎肠球菌，见图1、图2。

3.4  药敏试验  结果见表1。

两株分离菌对β-内酰胺类、林可霉素类、磺胺类、阿米卡星、多粘菌素、土霉素均为低敏，对新霉素均为中敏;鸽源分离株对恩诺沙星中敏，对氟苯尼考高敏，对强力霉素中敏;兔源分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星、加替沙星高敏，对氟苯尼考中敏，对强力霉素低敏。

3.5  耐药基因和毒力基因检测  结果显示，在鸽源分离株及兔源分离株上均发现2个（erm B、blaTEM）抗生素抗性基因;然而8种毒力基因均未检测到。

4  讨论及结论

本研究中从发病鸽、兔中分离出的两株分离菌经鉴定均为屎肠球菌。两者耐药表型存在部分差异，但耐药基因型及毒力基因均一致，均未检出耐万古霉素耐药基因。对氨基糖胺类及大环内酯类的耐药表型与基因型一致，四环素类耐药基因的耐药表型与基因型不一致，提示该地区的肠球菌或许存在其他耐药机制及致病机制等。利用《伯杰氏系统细菌学手册》等标准对分离株鉴型可能不合适，因为表型试验对肠球菌鉴定所用的典型菌株都是人源的，因此分离株与标准中表型可能存在一定的差异[11]。两株屎肠球菌虽来源不同，但序列及生化特性极为相似，且均在腹泻病例中分离，建议临床生产中鸽和兔不要混养，以免引起交叉感染。

肠球菌属于人和动物肠道中正常存在的菌群，但异位寄生于其他器官会引起感染[12]。肠球菌作为一种益生菌广泛在饲料中添加，伴随抗生素的滥用及环境的影响出现了较多的耐药性菌株及致病株，在临床治疗及饲料添加使用时应提高警惕，尽量减少抗生素的使用，本研究中该分离株是否存在致病性及其他毒力基因（hyl、SagA等）还需进一步研究。

参考文献：

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Abstract： In April 2020， diarrhea occurred in a pigeon farm and a rabbit farm in Shandong Province， and the incidence rate was high. One gram-positive cocci was isolated from the liver of pigeon and rabbit， and identified as Enterococcus faecium by 16S rRNA sequencing. 8 virulence genes such as cylA、gelE and ace were not detected in the two isolates. The results of drug sensitivity test and drug resistance gene showed that both strains were resistant to β-lactams， and the results of drug resistance gene detection were consistent. These results suggest that Enterococcus faecium may be able to cause infection in pigeons and rabbits， which has certain reference significance for clinical treatment and public health of pigeons or rabbits.

Keywords： Enterococcus faecalis;Separation and identification;Drug resistance;Virulence genes

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