不同来源鸡传染性支气管炎病毒M41株病毒特性的分析比较

张喜美　梁贤　刘晓倩　郑丛丛　于春梅　王飞　胡晓明

摘  要：为了比较2株不同来源的鸡传染性支气管炎病毒（M41）毒株的生物学特性、免疫原性及S1基因同源性。将TONG-IBV和MOU-IBV分别接种10日龄SPF鸡胚，观察鸡胚病变特点、计算病毒含量（EID50）、制备灭活疫苗进行免疫抗体效价检测，进行S1基因测序分析。试验结果表明：接种TONG-IBV株后鸡胚出血较严重，蜷缩程度较轻，接种MOU-IBV的鸡胚呈典型的蜷缩状;MOU-IBV组抗体效价高于TONG-IBV组抗体效价;同源性分析结果显示，MOU株S1与M41参考株S1（GenBank序列号MK937830.1）的同源性为99.7%，高于TONG 株S1与M41参考株S1的同源性99.0%。以上结果显示，不同来源M41疫苗株的病毒特性出现了多样性变化。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒;M41疫苗株; 病毒特性

中图分类号：S858.31    文献标识码：B    文章编号：1673-1085（2021）1-0021-04

鸡传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒科冠状病毒属传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性疾病[1-3]。鸡传染性支气管炎病毒极易造成呼吸道疾病的继发感染，使疫情变得更加复杂，病死率升高，而且临床型感染和亚临床型感染均会使鸡群生产性能下降，饲料报酬降低，且常常继发或并发大肠杆菌病、葡萄球菌病、支原体感染等等，导致死淘率增加，给养殖业造成严重的经济损失[4]。鸡传染性支气管炎病毒M41株是目前我国生产含有IBV抗原成分灭活疫苗所使用的制苗毒株，该毒株生物学特性稳定，免疫原性良好[5]。

在实际疫苗的生产及检验过程中发现，部分产品中鸡传染性支气管炎病毒效力检验结果偏低，甚至达不到国家标准的要求，困扰着此类疫苗的生产及应用。为了更好地保护鸡免受IB的侵害，制备出最佳疫苗[6]，我们通过不同来源鸡传染性支气管炎病毒M41株的比较，为此类疫苗生产提供参考数据。

1  材料和方法

1.1  毒株  鸡传染性支气管炎病毒（TONG-IBV株）E2代，由河南农业大学惠赠;鸡传染性支气管炎病毒（MOU-IBV株）E2代，由山东省农业科学院家禽研究所惠赠。

1.2  试验用鸡  SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;SPF种蛋，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3  检测试剂  IB HI 试验用抗原，购自荷兰GD公司（批号：20680-270120）。

1.4  设备  组织捣碎匀浆机（JJ-2），购自常州荣华仪器制造有限公司;鸡隔离器（正压GJ-1），购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.5  试验方法

1.5.1  抗原的制备  将两株M41毒株用灭菌生理盐水分别作100倍稀释，经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚30枚，每胚0.2 mL，接种后密封针孔，置36.5 ℃继续孵育，不必翻蛋。接种后33 h照蛋1次，弃去死胚，活胚全部取出，气室向上直立，置于4 ℃冷却12 h后收取尿囊液于灭菌瓶中，同时按现行《中国兽药典》附录进行病毒含量检验[7]并观察鸡胚病变特点，剩余的尿囊液-20 ℃保存备用。抗原收获批号分别为TONG-0901、MOU-0901。

1.5.2  抗原的灭活  将两株M41种毒制备的抗原加入10%甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.15%，37 ℃灭活18 h（以抗原温度达到37 ℃开始计时），其间每隔4 h搅拌一次。停止灭活后，从灭活瓶内取样进行灭活检验，灭活后的病毒液置4 ℃保存，抗原灭活批号分别为TONG-200901、MOU-200901。

1.5.3  试验疫苗的制备  将两组灭活后检验合格的抗原制备水相，按照水相和油相比1∶2在组织捣碎机进行乳化，制备两组抗原的灭活疫苗[8]，批号分别是TONG-20200901、MOU-20200901。

1.5.4  免疫  用4周龄SPF鸡30只，分为2组，每组15只，各点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗（H120株）1羽份。接种21日后，对试验鸡采血并分离血清。第1组，各颈部皮下注射鸡传染性支气管炎灭活疫苗（TONG）0.5 mL/只;第2组，各颈部皮下注射鸡传染性支气管炎灭活疫苗（MOU）0.5 mL/只。接种后28日，分别采血、分离血清，并将两次血清分别按血凝抑制试验操作方法作HI检测[9]。

1.5.5  2个不同来源IBV-M41株S1基因序列分析  參照GenBank中的IBV M41株纤突蛋白S1编码序列附近的相对保守区设计上、下游引物，提取两个病毒RNA，进行RT-PCR扩增，测序分析两个不同来源M41的差异，并通过MegAlign软件对TONG-IBV和MOU-IBV的S1编码基因序列进行比对。

2  试验结果

2.1  病毒含量测定  结果见表1。

2.2  鸡胚病变特点  两株不同来源的M41分别接种11日龄SPF鸡胚，鸡胚病变相同点：胚体均发育小，明显小于对照组鸡胚;不同点：接种TONG-IBV鸡胚出血较严重，蜷缩较轻，病变率73%，见图1;接种MOU-IBV鸡胚体脱水，呈典型的蜷缩状[10]，病变率67%，见图2;对照组见图3。

2.3  免疫原性分析  试验结果见表2。

由表2结果可见，鸡传染性支气管炎灭活疫苗（MOU株）抗体增长倍数为6.06倍，明显高于鸡传染性支气管炎灭活疫苗（TONG株）抗体增长倍数1.87倍，表明MOU-IBV株的免疫原性更好。

2.4  S1基因的測序结果  将IBV两个疫苗株（M41）S1基因的测序结果与标准的IBV代表毒株的S1基因序列进行比较，其同源性分析与进化树分析结果见图4、图5。

同源性分析结果显示MOU-IBV-S1与M41-IBV-S1的同源性为99.7%，并且处于进化树同一分支上，而TONG-IBV-S1与M41-IBV-S1的同源性为99.0%，因此MOU-IBV-S1与M41-IBV-S1的同源性更近。

通过MegAlign软件对TONG-IBV、MOU-IBV纤突蛋白S1编码基因序列比对结果见图6、图7。

通过MegAlign软件对TONG-IBV、MOU-IBV纤突蛋白S1编码基因序列比对，结果显示二者存在4个碱基位点的突变，进一步比对其氨基酸序列，表明有3个氨基酸发生改变。第837位碱基由A突变为C，该碱基处于编码第279位氨基酸密码子的第三个碱基，它的突变并未引起氨基酸的变化;第851位碱基由C突变为A，该碱基位于编码第284位氨基酸密码子的第二个碱基，它的突变直接导致第284位氨基酸由脯氨酸P变为组氨酸H;第881位碱基由A突变为G，该碱基位于编码第294位氨基酸密码子的第二个碱基，它的突变直接导致第294位氨基酸由谷氨酰胺Q突变为精氨酸R，第949位碱基由G突变为A，该碱基位于编码第317位氨基酸密码子的第二个碱基，它的突变直接导致第317位氨基酸由谷氨酸E突变为赖氨酸K。

3  讨论

本试验鸡传染性支气管炎灭活疫苗（MOU-IBV株）组效价明显高于鸡传染性支气管炎灭活疫苗（TONG-IBV株）组，可能是由于TONG-IBV纤突蛋白S1编码基因碱基位点的突变导致氨基酸发生突变，改变了蛋白序列及结构，从而引起了两个M41株生物学特性和免疫原性的差异。通过对2个不同来源的鸡传染性支气管炎病毒（M41）毒株免疫原性进行比较，说明相同的毒株之间存在着差异，导致免疫原性有所不同，有可能造成免疫失败。本试验为含有鸡传染性支气管炎病毒（M41）株相关产品的研发奠定基础。

参考文献：

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[2]  Saif Y M.禽病学[M].第十二版.北京：中国农业出版社，2012：129-151.

[3]  夏业才，陈光华，丁家波.兽医生物制品学[M].第二版.北京：中国农业出版社，2018：796.

[4]  张建伟，李林，景小冬，等.ND-IB二联灭活疫苗不同免疫方法对IB部分免疫效果影响试验[J].动物保健品，2011，（上）：31-32.

[5]  李林，章振华，景小冬，等. 不同IBV M41株灭活疫苗效力比较试验观察[C]//中国畜牧兽医学会禽病学分会.中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集.北京：中国畜牧兽医学会禽病学分会，2012：75-76.

[6]  林绮萍，唐秀英，陈瑞爱，等.不同厂家生产的鸡传染性支气管炎三联灭活疫苗免疫效果比较[C]//中国畜牧兽医学会.中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集.北京：中国畜牧兽医学会，2008：440-442.

[7]  中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015年版）[M].北京：中国农业出版社，2016：附录27.

[8]  阮武营.鸡传染性支气管炎病毒M41株、Conn株联合免疫研究[D].郑州：河南农业大学，2010.

[9]  生药评审处.兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）[M].北京：中华人民共和国农业部，2009：57-60.

[10]  步志高，江国托，刘思国，等.传染性支气管炎病毒中国地方分离株RF L P基因分型的研究[J].中国兽医学报，1997，17（6）：530-534.

Abstract：To compare the biological characteristics， immunogenicity and S1 gene homology of two strains of avian infectious bronchitis virus （M41） from different sources. The 10-day old SPF chicken embryos were inoculated with TONG-IBV and MOU-IBV， respectively， to observe the pathological features of chicken embryos， calculate the viral content （EID50）， Inactivated vaccine was prepared to detect the titer of immune antibody， S1 gene sequencing was performed. The results of the test showed that after inoculation of TONG-IBV strain， the chicken embryo bleeding was more serious and the degree of curling was less， and the chicken embryos inoculated with MOU-IBV showed a typical cowling shape. Homology analysis results showed that the homology between MOU strain S1 and M41 reference strain S1 （GenBank sequence number MK937830.1） was 99.7%， higher than that between TONG strain S1 and M41 reference strain S1 was 99.0%. The above results showed that the virus characteristics of different M41 vaccine strains showed diversity changes.

Keywords：infectious bronchitis virus; M41 vaccine strain; virus characteristics□