大蒜素对白念珠菌形态转换的影响研究

熊延靖 厉荣玉 吴艳红

(皖南医学院 医学微生物学与医学免疫学教研室，芜湖 241002)

白念珠菌(Candidaalbicans)，亦称白假丝酵母菌，是一种二相性真菌，从形态上可分为酵母相和菌丝相。在相关诱导因素的作用下，白念珠菌可发生由酵母相到菌丝相的转换过程。研究证实，白念珠菌的形态转换实际上是其由定植菌向致病菌转变的一种标志[1-2]，菌丝的形成可以提高白念珠菌对机体的侵袭力和黏附能力[3]。菌丝型生长通常与高水平的毒力因子相关联，如促进生物被膜的形成，产生分泌性的裂解酶以及抗氧化酶等。这些都有助于白念珠菌发生组织穿透、侵袭并抵抗宿主的免疫攻击[4-5]。因此，研究如何抑制酵母相和菌丝相的形态转换对于抗白念珠菌感染具有重要意义。

大蒜是天然的植物广谱抗菌素，其中发挥主要作用的成分是大蒜素。研究发现，大蒜素对多种细菌、真菌和病毒等均有不同程度的抑制和杀灭作用，是当前发现的天然植物中抗菌作用最强的一种[6-7]。本课题组在先前的实验中发现，大蒜素在体外对白念珠菌活性有较强的抑制作用[8]。因此，本研究选用大蒜素作为干预药物，探讨其对白念珠菌形态转换的影响及作用机制，为临床抗白念珠菌感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株 白念珠菌标准菌株：AX2-2086，购自广州市微生物研究所。将菌株在改良沙堡弱固体培养基中连续接种两次，保持菌株活力，4℃保存备用。

主要试剂 二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，PBS磷酸盐缓冲液(biosharp)，RPMI-1640培养基(biosharp)，葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)，营养肉汤(Solarbio)，蛋白胨(Solarbio)，甘露醇(国药集团化学试剂有限公司)，琼脂粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)。RNA提取试剂盒(OMEGA Yeast RNA Kit)，逆转录试剂盒(TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit)，qRT-PCR试剂盒(Roche FastStart Essential DNA Green Master)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。

药物 大蒜素(江苏正大清江制药有限公司，批准文号：国药准字H32025683，产品批号：190307)。

培养基 ①改良沙堡弱培养基：称取葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加入双蒸水定容至1 L，112℃高压灭菌15 min，即为改良沙堡弱液体培养基。若制备改良沙堡弱固体培养基，则在上述改良沙堡弱液体培养基中加入琼脂20 g再高压灭菌。4℃保存备用。②Spider培养基：称取营养肉汤10 g，甘露醇10 g，K2HPO42 g，加入双蒸水定容至1 L，调整pH为7.2(25℃)，121℃高压灭菌20 min，4℃保存备用。

主要仪器 生物安全柜：ESCO CLASSⅡ BSC；恒温振荡培养箱(ZQZY-VS2)：上海知楚仪器有限公司；高速冷冻离心机：BECKMAN Allegra 64R；隔水式电热恒温培养箱：THERMOFISHER IMH100；FA2004型电子分析天平：上海良平仪器仪表有限公司；微量培养板(96孔，6孔)：美国Coring公司；纯水机：ELGA Purelabflex 2；倒置显微镜：日本OLYMPUS公司；核酸蛋白分析仪：BioDrop；全波长酶标仪：Biotek Eon；荧光定量PCR仪：Roche lighelycler 96。

1.2 实验方法

菌液制备 将白念珠菌标准菌株AX2-2086接种于改良沙堡弱固体培养基中，37℃培养48 h后，挑取单克隆菌落，转种至5 mL改良沙堡弱液体培养基中，于37℃、200 r/min振荡培养16 h，使白念珠菌处于对数生长期。血细胞计数板计数， RPMI-1640培养液将菌液调整至浓度为2×106CFU /mL，4℃保存备用。

药液配制 将大蒜素溶解于DMSO中，用RPMI-1640培养液进行倍比稀释，使其浓度为800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。4℃保存备用。

白念珠菌菌丝形成的体外动力学检测 用Spider液体培养基将白念珠菌菌液稀释至2×106CFU/mL，取菌液3 mL加入6孔板中，37℃静置孵育。分别于培养的0 h、2 h、6 h、12 h、24 h取出孔板，在倒置显微镜明场下观察白念珠菌菌丝形成情况并拍照。

大蒜素对白念珠菌最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)推荐的真菌敏感性检测方法CLSI-M27-A3[9]，按照微量液基稀释法操作步骤进行并略作改良。具体方法如下：①用RPMI-1640培养液将白念珠菌菌液稀释至2×103CFU /mL。②将上述浓度的大蒜素溶液和菌液各100 μL加入96孔微量培养板中，使得大蒜素和菌液分别被1∶1稀释至终浓度。同时设生长对照孔(RPMI-1640培养液100 μL+菌液100 μL)和空白对照孔(RPMI-1640培养液200 μL)。每个浓度均设3复孔。③将96孔微量培养板置37℃培养48h后观察结果。以上实验在不同时间重复3次。④结果判断：视觉法判定，肉眼观察孔内白念珠菌的生长情况，与生长对照孔相比，观察到生长完全抑制、培养基清亮所对应的最低药物浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

大蒜素对白念珠菌菌丝形态的影响 检测大蒜素对白念珠菌在Spider液体培养基中菌丝形成的影响。实验步骤为：①用Spider液体培养基将白念珠菌稀释至2×106CFU /mL。②将菌液和终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的大蒜素加入6孔板中。同时设立不加药物的空白对照孔。混匀后37℃静置孵育。③分别于培养的2 h、6 h、12 h、24 h取出孔板，在倒置显微镜明场下观察白念珠菌菌丝形成情况并拍照。

qRT-PCR检测大蒜素对菌丝形成相关基因表达的影响 ①总RNA提取：将终浓度依次为6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的大蒜素与菌液(2×106CFU /mL)混匀，置37℃培养24 h后，收集菌体，用无菌PBS缓冲液清洗3次，提取白念珠菌总RNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行。②引物的设计与合成[10]：所用引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。③cDNA的制备：根据TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书，将RNA逆转录为cDNA。第一步：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 1 μg，加RNase Free dH2O至10 μL，反应条件为42℃ 2 min。第二步：第一步反应液10 μL，Master Mix 10 μL，反应条件为37℃ 15 min、85℃ 5 s。④实时荧光定量PCR反应：按照Roche FastStart Essential DNA Green Master试剂盒说明，配制反应体系见表2。将所有试剂加好后，放置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为：预变性95℃ 600 s；扩增定量程序为：95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，扩增程序为40个循环；熔解曲线(melting curve)65～95℃。每个样品均设置3个重复。⑤定量分析：qRT-PCR分别测定的目的基因和内参基因的CT值，将实验结果取平均值，计算并统计。基因表达水平用2-△△CT法进行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primers used for qRT-PCR

表2 PCR反应体系Tab.2 The reaction system of PCR

2 结 果

2.1 白念珠菌菌丝形成的动态过程

通过倒置显微镜分别观察了培养0 h、2 h、6 h、12 h、24 h白念珠菌在Spider液体培养基中菌丝形成的过程(见图1)。结果发现，白念珠菌在培养的2 h左右开始形成芽生孢子。随后6 h出现大量菌丝，至12 h菌丝交织在一起形似网状结构。24 h后镜下可见大量白念珠菌菌丝紧密交错。

图1 白念珠菌菌丝形成动态过程(×400)Fig.1 The dynamic formation process of Candida albicans hyphae(×400)

2.2 大蒜素对白念珠菌的MIC值

采用CLSI-M27-A3推荐的微量稀释法，检测得出大蒜素对白念珠菌标准菌株AX2-2086的MIC为25 μg/mL。根据MIC值的实验结果，设置后续实验中大蒜素终浓度依次为6.25、12.5、25、50、100 μg/mL。

2.3 观察大蒜素对白念珠菌菌丝形态的作用

通过倒置显微镜观察大蒜素对白念珠菌菌丝形成的影响，结果显示，未经药物处理的白念珠菌能在6 h内形成较长的菌丝，至12 h镜下观察到菌丝错综复杂，相互缠绕重叠。24 h可见大量菌丝相细胞包裹着酵母相细胞，菌体交错密集，结构致密。当加入25 μg/mL浓度的大蒜素时，视野内可观察到不同时间点菌丝长度均明显变短，且与对照组相比数量明显减少。而100 μg/mL浓度的大蒜素则能够基本抑制菌丝的生长，镜下观察以酵母相细胞为主。这一现象说明，大蒜素能够抑制白念珠菌由酵母相向菌丝相的转化，且这种抑制作用具有一定的剂量依赖性，即随着大蒜素浓度的升高，抑制作用更加明显。见图2。

图2 不同浓度大蒜素对白念珠菌菌丝形态的作用 (×400)Fig.2 Effect of allicin in different concentration on hyphae morphology of Candida albicans (×400)

2.4 大蒜素对白念珠菌菌丝形成相关基因表达的影响(见图3)

图3 大蒜素对白念珠菌菌丝相关基因表达的影响Fig.3 The effect of allicin on gene expression of Candida albicans hyphae

与空白对照组相比，在≥25 μg/mL浓度的大蒜素干预作用下，参与正向调控白念珠菌菌丝生长的基因HWP1、ALS1、EFG1的表达均明显下降，而负向调控菌丝生长的基因PDE2的表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果提示，大蒜素对白念珠菌菌丝生长的作用机制可能是通过抑制正向调控基因的表达，上调负向调控基因的表达，从而抑制菌丝的形成。

3 讨 论

白念珠菌具有形态的多样性，其中酵母相-菌丝相的形态转换是其典型的形态转换系统。白念珠菌这种形态的可塑性，是其毒力的关键决定因素之一[11]。菌丝相的形成在对宿主的黏附和致病过程中起重要作用[12]。菌丝能通过诱导胞吞作用，主动穿透宿主的表皮细胞，逃避机体免疫监管，造成黏膜损伤[13]。相关研究表明，白念珠菌酵母相细胞常定植于皮肤或黏膜表面，通常不引起宿主的免疫反应，易通过血液循环进行传播。当宿主免疫功能受损或体内菌群失衡时，白念珠菌由酵母相转换为菌丝相，更易发生黏附和侵袭，具有较强的致病能力。

Spider培养基常被用来评估白念珠菌维持菌丝生长的能力[14]。菌丝相白念珠菌呈无缢缩的长管状多细胞形态。在本实验中，将白念珠菌标准菌株AX2- 2086接种到Spider液体培养基中，镜下观察发现白念珠菌在培养的6 h出现大量菌丝，至12 h长且密的菌丝相互缠绕重叠，交织在一起形似网状结构。说明Spider液体培养基能够良好诱导白念珠菌菌丝相的形成。

大蒜素是从百合科植物大蒜的鳞茎中提取的含硫有机化合物的主要有效成分。研究显示大蒜素对多种细菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有良好的抑制作用，被誉为天然广谱抗生素[15-16]。本研究观察了大蒜素对白念珠菌菌态转换表观和相关基因表达的影响，以探讨其抑制作用及分子调节机制。通过倒置显微镜观察，当加入25 μg/mL浓度的大蒜素后，视野内可观察到菌丝长度明显变短，且与对照组相比数量明显减少。而100 μg/mL浓度则能基本抑制菌丝的生长，镜下观察以酵母相细胞为主。以上观察结果提示，大蒜素能够抑制白念珠菌的形态转化，且呈现一定的剂量依赖性，当大蒜素浓度足够高时，可使白念珠菌停留在酵母相。

目前研究发现，宿主相关环境因素作用于白念珠菌，激活相应的信号传导通路，调控下游应答基因的表达，共同调控白念珠菌菌丝发育。Ras-cAMP-Efg1途径是调节白念珠菌由酵母相到菌丝相转化的重要信号通路之一，通过 Ras1激活 cAMP/PKA信号传导通路，磷酸化并激活下游相应的转录因子(如Efg1和Flo8等)，调控白念珠菌菌丝的生长[17]。白念珠菌中存在两种 Ras蛋白——Ras1和Ras2，其中Ras1蛋白是白念珠菌菌丝生长和毒力所必需的。研究发现，敲除RAS1基因的菌株菌丝发育缺陷、毒力显著降低[18]。第二信使cAMP是该信号通路重要的调控分子，cAMP由Cdc35酶合成，Pde2酶降解[19]。为验证大蒜素对白念珠菌菌丝形成的作用机制，实验进一步通过qRT-PCR检测了菌丝相关基因的表达水平。结果发现，与空白对照组相比，大蒜素能够下调与菌丝形成正相关基因(RAS1、CDC35、EFG1)的表达，上调菌丝形成负相关基因(PDE2)的表达。由此可见，大蒜素对白念珠菌的形态转换具有明显抑制作用，其抑制作用的分子调节机制可能是通过下调与菌丝形成正相关基因的表达并上调负相关基因的表达来实现的。

综上所述，大蒜素可抑制白念珠菌丝的形成和形态转换，表明大蒜素在抗白念珠菌感染方面具有良好应用前景。在本实验基础上，将进一步建立白念珠菌感染的动物模型，探讨大蒜素在体内对白念珠菌菌丝的形成和对宿主的侵袭作用的影响，为白念珠菌感染的治疗和新型抗真菌药物的研发提供理论基础。