红景天中熊果苷的提取和含量测定

胡英婕

锦州医科大学医疗学院 （辽宁锦州 121000）

红景天是《中华人民共和国药典（一部）》收录的中药材，为景天科植物大花红景天的干燥根及根茎；具有益气活血、通脉平喘功效，用于气虚血淤、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘等症[1]。红景天的有效成分包括红景天苷、槲皮素、山萘酚、熊果苷等[2-4]。熊果苷具有美白、去色斑、杀菌、消炎的作用，现主要用于高级化妆品的制备；因其能去除雀斑和黄褐斑，被称为21 世纪理想的美白祛斑活性剂[5-7]。本研究以红景天中有效成分熊果苷为研究对象，根据熊果苷提取方法的相关文献[8-10]，采用正交试验确定熊果苷的最佳提取方案，并建立高效液相色谱测定熊果苷含量的方法。该方法对红景天用药质量监控及熊果苷在化妆品和医药领域的开发利用提供了实验依据。

1 试剂与仪器

红景天药材，经锦州成大方圆药店主任中药师王景清鉴定为正品；熊果苷对照品（批号：120520-201909），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙醇（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸（分析纯），天津市康科德科技有限公司；重蒸馏水，自制。

FL2200 高效液相色谱仪，浙江福立分析仪器股份有限公司；ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），北京金欧亚科技发展有限公司；KQ-100A 超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；BP211D 电子分析天平（精度0.000 01 g），德国赛多利斯集团；TU-1800 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

A：乙腈－0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液（二者体积比为22∶78）。实验结果显示熊果苷峰峰形不佳，拖尾现象严重。

B：甲醇-水-磷酸-三乙胺（四者体积比为47.0∶52.7∶0.2∶0.1）。实验结果显示熊果苷峰和前一个峰分离度差。

C：甲醇-水（二者体积比为65∶35），加磷酸调节pH=3.5。实验结果显示熊果苷峰保留时间过短，有拖尾现象。

D：乙腈-磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者体积比为10∶90）。实验结果显示熊果苷峰分离度符合要求且峰形好，保留时间适中。

E：甲醇-乙腈-水（三者体积比为9∶9∶82，加0.1%三乙胺）。实验结果显示熊果苷峰峰形不佳，分离度小。

5 个流动相比较，D 分离效果较好，且保留时间适中，柱效高。因此选择乙腈-磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者体积比为10∶90）为熊果苷含量测定的流动相，流速为1.0 mL/min。2.1.2 检测波长的选择

因熊果苷具紫外吸收，用紫外检测器对熊果苷对照品溶液进行紫外全程扫描，其最大吸收波长在280 nm 处，因此确定熊果苷的检测波长是280 nm。

2.1.3 柱温的选择

分别考察不同柱温（10，20，30 和40 ℃）对柱效的影响：柱温在20～30 ℃之间，熊果苷峰峰形无明显变化，分离效果好，样品稳定，柱效高；柱温过低或过高，分离效果均较差。因此选择室温（23 ℃）为柱温。

2.2 熊果苷对照品溶液的配制

取105 ℃干燥至恒重的熊果苷对照品5.0 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解、稀释至刻度，即为含熊果苷0.2 mg/mL 的储备液。

2.3 标准曲线线性范围考察

精密吸取熊果苷对照品储备液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00 mL，分别置于7 个25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀, 经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后，各吸取10 μL，注入高效液相色谱仪。记录熊果苷对照品溶液的色谱图，测定峰面积，得到进样量（x）和峰面积值（y）的回归方程：y=854 612x+354 124，r=0.999 0。在0.2～1.4 mg 范围内，熊果苷进样量与峰面积呈良好线性关系。

2.4 供试品溶液的制备

提取溶剂、每克原料所用溶剂体积、提取方法、提取时间均会对熊果苷含量测定有影响，可设计正交试验四因素三水平表，见表1。

表1 熊果苷提取正交试验因素水平表

取红景天研成粉末（过3 号筛）约2 g，精密称定，按照L9（34）正交表设计的提取方法分别进行3次重复试验，得到熊果苷含量，结果见表2。熊果苷提取结果方差分析见表3。

以熊果苷含量为评价指标，由极差（R）可知，各因素影响作用主次为：C＞A＞D＞B。方差分析结果表明：A，C因素（提取溶剂、提取方法）影响较大，具显著意义（p＜0.01）；B，D因素（提取溶剂体积、提取时间）影响较小，不具显著意义（p＞0.01）。根据正交试验结果，熊果苷最佳提取方案为A3B2C1D2，即用60%乙醇超声提取50 min，1 g 原料需20 mL 溶剂。

综上所述，熊果苷提取方案为：取红景天（过3号筛）约2 g，精密称定，用40 mL 的60%乙醇超声提取50 min，摇匀、滤过，滤液即为供试品溶液。

表2 熊果苷提取L9（34）正交试验分析结果

表3 熊果苷含量方差分析表

2.5 精密度试验

精密吸取熊果苷对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6 次，计算熊果苷含量的相对标准偏差（RSD）。RSD=0.7%，表明该方法精密度高。

2.6 重复性试验

取同批次红景天药材，制备6 份供试品溶液，分别进样10 μL，计算得到熊果苷含量的RSD=0.9%，表明该方法重复性好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，20，24 h 进样，根据峰面积计算得到熊果苷含量的RSD=0.8%，表明供试品溶液在24 h 之内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量的红景天药材1.000 克9份，分别按熊果苷含量的80%、100%、120%的量加入熊果苷对照品（三个水平，每个水平2 份），制备成加样供试品溶液，测定熊果苷质量分数，并计算回收率，结果见表4。

表4 熊果苷加样回收试验结果

2.9 样品含量测定

精密吸取不同批次供试品溶液，进样6 次，根据峰面积计算得到熊果苷质量分数平均值为3.2 mg/g，RSD=1.0%。

3 结语

采用L9(34)正交设计优选出红景天中熊果苷的最佳提取工艺。目前美白祛斑化妆品中使用的熊果苷多为合成品，本研究考察了从天然植物药材红景天中提取熊果苷的有效方法，为提取天然熊果苷提供了实验依据，对天然熊果苷的市场开发利用具有重要意义。