高产木糖醇菌株的诱变选育及其发酵培养基优化

陈雪松 杨胜利

1 浙江树人大学生物与环境工程学院 （浙江杭州 310015）

2 浙江工业大学药学院 （浙江杭州 310014）

木糖醇是一种天然甜味剂，化学名为“戊五糖”，是一种五碳糖。木糖醇外观和味觉与蔗糖相似，具有清凉甜味。和其他糖醇相比，木糖醇是多元醇中最甜的甜味剂[1]，目前已被广泛应用于食品、印染、纺织、医药、国防、化工及皮革等领域[2]。

木糖醇的传统生产方法主要以玉米芯和甘蔗渣为原料，利用酸水解预处理，经多次精制获得木糖，再加氢生产木糖醇，存在污染重、资源消耗大、产量低、成本高等缺点[3-4]。采用生物转化法生产木糖醇，可省去多次提纯、精制步骤，同时实现绿色生产[5]。

生物转化法生产木糖醇以反应条件温和、资源消耗少和对环境污染小等优点成为研究热点，但存在木糖醇生产率低、菌株生产能力低的缺点[6]。为提高生物转化法的木糖醇转化率，本研究通过对前期自然筛选得到的菌株进行复合诱变，探讨其木糖醇转化率，同时对发酵培养基的氮源和无机盐进行了优化，以期为后期工业化应用提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

木糖醇转化菌，Y-3 号（木糖醇转化率36.5%），浙江工业大学生物制药研究所筛选并保存。

1.1.2 培养基

种子培养基：D-木糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氢钾2 g、二水氯化钙0.1 g、七水硫酸镁0.2 g、硫酸铵5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH=6.0，于121℃湿热灭菌20 min。

菌种保藏培养基：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氢钾2 g、二水氯化钙0.1 g、七水硫酸镁0.2 g、硫酸铵5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH=6.0，于121 ℃湿热灭菌20 min。

发酵培养基：竹笋壳水解液（含木糖20 g）、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、蒸馏水1 000 mL，pH=6.0，于121 ℃湿热灭菌20 min。

1.1.3 试剂

实验所用化学试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司、杭州邦易化工有限公司。

DNS 试剂：750 mL 去离子水微热后依次加入10.00 g 3,5-二硝基水杨酸、16.00 g 氢氧化钠、5.00 g苯酚、5.00 g 亚硫酸钠和300.00 g 酒石酸钾钠，溶解后移入棕色容量瓶，定容至1 000 mL，于室温下暗处放置一周后使用。

试剂a：将0.320 g 高碘酸钾溶于100 mL 1%的盐酸中。

试剂b：鼠李糖1.11 g/L。

NaSH 试剂（现配现用）：100 mL 150 g/L 的乙酸铵溶液中，分别加入0.2 mL 乙酸及乙酰丙酮，摇匀。

1.1.4 主要仪器

D 型单人式净化工作台，上海恒勤仪器设备有限公司；TDL-5 低速台式大容量离心机，南京东迈科技仪器有限公司；ZHWY-2102C 恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；752 紫外可见分光光度计，上海天翔光学仪器有限公司；LS-B50L 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；EYELA NVC-2000 旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

将Y-3 号菌株接入10 支斜面培养基，30 ℃、180 r/min 培养48 h；取菌落大而厚，湿润，表面光滑，质地均匀，正、反面及中央与边缘颜色一致的5支，用生理盐水洗下菌苔，3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用生理盐水洗涤两次，转入大试管制成菌悬液。

1.2.2 诱变处理

1.2.2.1 化学诱变

向大试管中依次加入0.2 mol/L 亚硝酸钠溶液和菌悬液各1 mL 后，立即加入1 mL pH=4.5 的醋酸缓冲液，充分混合后，置于27 ℃水浴中诱变5 min，然后加0.07 mol/L pH=8.6 的磷酸氢二钠溶液2 mL以终止反应。将经亚硝酸钠处理后的菌悬液用无菌水稀释104倍后，各取0.1 mL 均匀地涂布3 套平板，30 ℃避光培养48 h。

1.2.2.2 紫外诱变

将亚硝酸钠诱变后木糖醇转化率最高的菌株接入10 支斜面培养基，同方法1.2.1 制备菌悬液。取无菌平皿5 套，分别加入5 mL 菌悬液，开启磁力搅拌器，15 W 紫外灯30 cm 处照射120 s。将经紫外线照射的菌悬液稀释104倍后，各取0.1 mL 均匀地涂布3 套平板，30 ℃培养48 h，计算木糖醇转化率。

1.2.2.3 二轮复合诱变

取紫外诱变后木糖醇转化率最高的菌株按上述方法再依次进行化学诱变和紫外诱变。

1.2.3 菌落的筛选与发酵

从每套平板中挑选至少3 个长势较好、形状规则、直径较大的单菌落接入100 mL 种子培养液中，30 ℃、200 r/min 摇床培养24 h。按5%的接种量接入100 mL 发酵培养基，30 ℃、200 r/min 摇床培养48 h后静置24 h。

1.2.4 发酵培养基氮源与无机盐的优化

1.2.4.1 单因素实验

将经过二轮诱变后木糖醇转化率最高的菌株接入斜面培养基，30 ℃培养48 h。用接种环从斜面培养基上挑取适量接种到100 mL 种子培养基中，30℃、200 r/min 摇床培养24 h。按5%接种量用无菌移液管将种子液接种到100 mL 发酵培养基中，30 ℃、200 r/min 摇床培养。

分别用10 g/L（以氮计）的牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵和尿素作为氮源，每个变量各做3 个平行组，测定木糖醇转化率。另分别用0.2 g/L 的硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙和0.5 g/L 的磷酸二氢钾作为无机盐，每个变量做3 个平行组，测定木糖醇转化率。

1.2.4.2 四因素三水平正交试验

发酵培养基的优化：在氮源和无机盐单因素实验的基础上，对氮源和无机盐按表1 进行四因素三水平的正交试验。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 发酵液木糖和木糖醇质量浓度测定

取10 mL 经摇匀的发酵液，3 500 r/min 离心10 min，取上清液适当稀释。在25 mL 试管中加入1 mL稀释后的上清液和3 mL DNS 试剂，沸水浴5 min，冷却定容至25 mL，测量540 nm 处吸光度，根据木糖标准曲线回归方程计算水解液中木糖质量浓度。

取10 mL 经摇匀的发酵液，3 500 r/min 离心10 min，取上清液适当稀释。取1 mL 稀释液，与1 mL 试剂a 室温反应10 min，再加入2 mL 试剂b 和4 mL NaSH 试剂，混匀后于53 ℃水浴中保温15 min，冷却后测量412 nm 处吸光度，再根据木糖醇标准曲线回归方程计算发酵液中木糖醇的质量浓度。

1.2.6 木糖醇转化率的计算

初始培养基的木糖质量浓度均为20 mg/mL。木糖醇转化率按公式（1）计算。

式中：ρ1为发酵液中木糖醇质量浓度，mg/mL；ρ2为发酵液中残留木糖质量浓度，mg/mL；M1为木糖醇摩尔质量，g/mol；M2为木糖摩尔质量，g/mol。

2 结果与分析

2.1 高产木糖醇菌株复合诱变及突变株筛选

将每次诱变结束后的诱变菌各做3 组平行试验，得到其木糖醇转化率，结果如表2 所示。对原菌Y-3 号进行亚硝酸钠和紫外复合诱变，得到一株木糖醇转化率50.3%的Y-3-7 号菌株。

表2 第一轮复合诱变结果

以Y-3-7 号菌株作为出发菌株再次进行亚硝酸钠和紫外诱变，得到一株木糖醇转化率54.5%的菌株Y-3-7-4，其比原出发菌株的木糖醇转化率提升了49.3%，结果如表3 所示。同时也有一些菌株在诱变后转化率出现了下降，这可能与致死率有关[7]；可以通过控制致死率来提高正向突变的概率。

2.2 高产木糖醇发酵培养基氮源的选择优化

氮源对微生物的生长发育和代谢产物的生成非常重要作用。不同种类氮源可能影响代谢产物合成的量。牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、尿素等都是常用氮源。分别以该4 种氮源为单一氮源，以Y-3-7-4 菌株为出发菌株，进行氮源优化，结果如图1 所示。从图1 可知，在其他条件相同时，选用蛋白胨、牛肉膏时木糖醇转化率较高。说明酵母以有机氮源为氮源时更有利于转化木糖，可能是因为有机氮源中含有多种生长因子。其中：蛋白胨效果最好，木糖醇转化率可达56.04%；无机氮源硫酸铵的效果较差，木糖醇转化率为46.36%；尿素作氮源时，木糖醇转化率为45.66%。

表3 第二轮复合诱变结果

图1 不同氮源的木糖醇转化率

2.3 高产木糖醇发酵培养基无机盐的选择优化

无机盐是微生物生长代谢过程中酶活性中心的组成部分，不同的无机盐可能会影响酶的活性，从而影响菌株的代谢途径和木糖醇的积累。以Y-3-7-4菌株为出发菌株进行无机盐优化，选用4 种无机盐，木糖醇转化率如图2 所示。由图2 可知，在其他条件相同时，选用0.2 g/L 的硫酸镁和0.5 g/L 的磷酸二氢钾，木糖醇转化率较高。硫、镁、磷、钾都是酵母发酵过程中必需的微量元素，可以激活酶促反应或参与生物合成反应。尤其是Mg2+，它是酵母生长必需的，以酶的激活剂发挥作用，在磷酸转移酶类和许多脱羧酶的激活中发挥重要作用；而H2PO4-有利于酵母细胞的代谢进入磷酸戊糖途径。因此硫酸镁和磷酸二氢钾是酵母木糖转化的较好的无机盐。

2.4 高产木糖醇发酵培养基正交试验优化

根据氮源和无机盐优化结果，选择牛肉膏、蛋白胨作为氮源，硫酸镁、磷酸二氢钾作为无机盐，对牛肉膏、蛋白胨、硫酸镁及磷酸二氢钾的质量浓度进行四因素三水平的正交试验，通过测定木糖醇最高转化率来确定最佳培养基配方。结果如表4 所示。

图2 不同无机盐的木糖醇转化率

表4 正交试验结果表

从表4 可以看出，不同发酵培养基组合对木糖醇转化率都有影响。其中牛肉膏极差最大，是影响木糖醇转化率的最关键因子，其次是硫酸镁和磷酸二氢钾，蛋白胨影响最小。4，5，6，7 号试验中木糖醇转化率较高，而其他组木糖醇转化率不高，与原始培养基相比甚至出现了抑制木糖转化为木糖醇的现象。根据各因素水平，A取A2，B取B3，C取C3，D取D2为好，即最佳培养基为A2B3C3D2。由于B的极差最小，对木糖醇转化率的影响最小，因此将其作为误差项对A，C，D作方差分析。

2.5 方差分析

方差分析结果如表5 所示。

表5 方差分析结果

从表5 中F值的大小看出，各因素对木糖醇转化率影响的大小顺序为A＞C＞D，即牛肉膏质量浓度对木糖醇转化率的影响最为显著。

3 结论

本研究以一株产木糖醇菌株为出发菌株，对其进行紫外和化学复合诱变，经过两轮复合诱变得到一株高产木糖醇菌株，木糖醇转化率为54.5%，比出发菌株提高了49.3%。

通过单因素实验确定了蛋白胨和牛肉膏为最佳氮源，硫酸镁和磷酸二氢钾为最佳无机盐；通过4 种因素的正交试验，发现牛肉膏对木糖醇转化率影响最大，硫酸镁、磷酸二氢钾的影响依次变小，蛋白胨的影响最小。最佳发酵培养基配方为：牛肉膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L。菌株木糖醇转化率提高到63.0%，比出发菌株提高了72.6%，为后续通过产木糖醇菌株生产木糖醇技术的应用奠定了基础。