发酵食品微生物多样性分析方法研究进展

夏傲喃，李建华，林祥娜，汤晓娟，刘云国*

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000；3.安徽拓维检测服务有限公司，安徽 宣城 242000）

发酵食品是指那些利用植物或动物为原料通过天然微生物或添加含有微生物的发酵剂而生产的美味而有营养的产品。这种食品至少有一种成分是被微生物利用，最终产品的理化、感官和酶学特性得到显著的改变[1]。发酵食品悠久的食用历史，使其具有原料多样，产品种类繁多。如酒精饮料、乳制品、豆制品等，常见的食品原料及主要风味特点如表1所示。

表1 发酵食品的原料及其风味特征Table 1 Raw materials and flavor characteristics of fermented food

由于微生物的作用，食品原料中的大分子物质被降解，食品物理化学和感官特性的改变来提高产品附加值，致病性和腐败微生物的生长被限制[2]，但直到现在，人们对很多发酵食品中潜在的微生物群落也没有太多的了解。因此，研究发酵食品微生物多样性具有重要意义，不仅有利于进一步研究微生物与食品的功能，质构和风味的关系，也为食品中有益微生物的筛选和有害微生物的抑制提供基础。对发酵食品微生物多样性分析方法进行综述，为开展发酵食品中微生物多样性相关研究提供技术基础。

1 微生物对发酵食品的影响

微生物作为发酵过程的主要支柱之一，在将原料转化为消费者和生产者都能接受的食用产品方面起着关键作用。发酵食品具有微生物功能特性，可以产生一些特殊的营养因子，继而提高机体功能，如抗氧化[3]、降低有害物质提高营养价值[4]、降低心血管疾病[5]等。发酵食品中的微生物种类、数量和相互作用对发酵过程的顺利进行至关重要，也对发酵产品的质量和风味有很大影响[6-7]。微生物的作用产生大量的酶，用于细胞代谢和随后的小分子生成，这些酶有助于最终产品风味的形成[8]。天贝的发酵过程中使用了根霉菌来增加其维生素、烟酸和核黄素的含量[9]。某些发酵微生物负责降解抗营养物质，从而将其转化为可食用产品。印度的蒸糕发酵过程中发生的，植物酸含量的降低导致了矿物质、蛋白质和糖的生物利用度的增加[10]。但发酵食品有些时候由于原材料问题或者生产过程不规范，产生一些安全隐患，例如，微生物脱羧氨基酸导致生物胺的形成，这些生物胺可以在一些发酵食品中找到，如酸菜、奶酪、果酒等[11]。在发酵蔬菜中生物胺（例如组胺和酪胺）的产生和危害程度正成为与这些化合物对健康的影响直接相关的经济问题。关于发酵食品的大量研究论文强调，微生物的积极作用远比其可能带来的风险强得多[12]。

2 微生物多样性分析方法

2.1 传统方法

传统方法首先是由培养基对可培养微生物进行筛选，然后通过显微试验、生理生化试验以及分子生物学试验对纯种微生物进行鉴定。传统的方法其基本原理是通过控制营养成分、酸碱度、温度和氧等要求来尽量满足微生物的生长需求。蔡海莺等[13]通过传统方法从12种甜米酒酒曲中得到41株细菌和16株真菌，发现酒曲微生物中含有大量芽孢杆菌，少量病原菌和腐败菌，真菌除酿酒酵母外，还鉴定出毕赤酵母和扣囊复膜酵母等非酿酒酵母和一些丝状真菌。孙文丽等[14]通过选择性培养基对胀气食醋污染微生物进行分离鉴定，得到贝莱斯芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌等6种菌群，其中特基拉芽孢杆菌能产生气体，是造成食醋胀气的主要潜在微生物。凌空等[15]也采用传统的方法对3种果蔬酵素不同发酵周期中微生物进行分离鉴定，得到7株菌种，其与报道的菌种有异同。然而，传统的基于培养的方法只能分离一些可培养微生物，大多数微生物不能在培养基中培养[16-17]。因此，近年来在研究发酵食品微生物多样性时，常将传统方法与分子生物学方法相结合，更全面地分析发酵食品的微生物多样性。

2.2 分子生物学方法

虽然传统方法已被频繁使用，但它无法捕获不可培养微生物。因此，可以识别培养和不可培养微生物的多种分子生物技术常用来揭示发酵食品微生物多样性[6]。变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段长度多态性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、随机引物PCR-DNA多态性分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和高通量测序（high throughput sequencing，HTS）是探索食品微生物群落的有效分析工具，多年来在食品和环境微生物学中得到了广泛的应用。

2.2.1 DGGE/TGGE

DGGE/TGGE是根据DNA在不同浓度的变性剂和温度中DNA双链解旋的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。其原理是通过16S rDNA基因在含有梯度变性化合物配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性融点不同实现的，从而导致DNA片段的迁移速率不同，这样不同的片段就被有效分离[18-19]。DGGE是第一个用于米酒发酵剂微生物区系研究的未培养方法[20]，该方法揭示了越南米酒发酵剂中真菌菌群的多样性和菌群结构。邹颖玲等通过DGGE技术分析宣威火腿中菌群落结构，表明宣威火腿中含有丰富的菌群，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多样性最高，加工2年火腿内部真菌群落多样性最高[21]。顾采东[22]采用TGGE技术研究不同加热方式对牛乳杀菌的效果，发现在杀菌程度不足时，牛乳会存在假单胞菌，影响牛乳的质量与安全，最佳条件是65℃，处理45 min。除此之外，在酒类[23-24]、木薯饮料[25]、泡菜[26]、发酵茶[27]等也被广泛应用。DGGE与TGGE不需要培养、检测极限低、检测速度快，但基于DNA形态的方法由于通量低、灵敏度低，也难以反映微生物的综合多样性。

2.2.2 RFLP、T-RFLP和AFLP

RFLP原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此可以引起酶切位点变异的突变和一段DNA的重新组织等均可导致RFLP的产生。AFLP是在RFLP技术基础上进一步开发的DNA多态性检测技术，不需要制备探针，但有较高的鉴别能力和较好的重现性，在物种水平有较好的鉴别效果[28]。李小永[29]通过DGGE和T-RFLP对豆豉发酵过程中微生物多样性进行研究，发现Shannon指数先下降后上升，然后逐渐下降，豆豉发酵期间中微生物发生很大的改变。Braulio等[30]用一种简化AFLP方法对葡萄酒发酵过程中酵母进行分类，从自然发酵的葡萄酒中分离出的180个菌落分为11个不同的菌株，6个不同的菌株，4个不同的菌株和11个不同的菌株。AFLP指纹技术的发展和应用，使微生物遗传多样性和分类学研究取得了重大进展，但实验操作繁琐，成本较高。

2.2.3 RAPD

RAPD是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，以组织中分离出来的基因DNA为模板进行PCR扩增。由Williams建立的RAPD技术的优点是信息丰富、成本效益高、可靠、可重复的方法[31]。杨勇等[32]优化了RAPD技术在发酵肉制品微生物多样性扩增条件，并阐述了RAPD技术的优点，并在植物和动物中得到广泛的应用。秦丹[33]通过RAPD技术分析了四川香肠和腊肉加工储藏过程中微生物多样性，得出四川香肠和腊肉中优势菌群为乳酸菌和葡萄球菌，烟熏对微生物尤其是酵母菌生长影响显著，并通过传统方法与RAPD技术比较发现两种方法检测到的微生物多样性结果不完全一致。但由于RAPD技术采用随机引物进行PCR扩增，得到很多大小不一的DNA片段，造成条带多而杂，给遗传多样性的分析造成了困难，导致结果稳定性和重复性较差。

2.2.4 HTS

HTS（又称“第二代测序技术”）的发展使得许多生物学领域发生了革命性的变化，包括医学微生物学、植物和动物基因组学，以及基因转录的研究。HTS产生大量数据，样品间重复性好，能够同时筛选多个不同的基因组区域。已广泛应用于食品领域中，例如，更准确地识别产品中的绝大多数微生物分类群，包括那些不能培养的微生物和那些只有少量存在的微生物，极大地扩展了微生物生态学领域[34]。HTS包括ABI SOLiD连接法测序、454焦磷酸测序和Illumina Solexa合成测序，其中Illumina测序是最广泛应用于探索环境和人体微生态系统的微生物多样性[35-36]。Illumina测序读长较短，测序通量较高，能够同时筛选多个不同的基因组区域，从而能够识别食品中所有植物、动物、真菌和藻类成分，已广泛应用于发酵食品微生物的分析，极大地改变了人们对发酵食品微生物学的认识，是评价食品中微生物多样性和监测食源性病原体的有效工具[37-39]。

HTS方法也被用于许多发酵食品的微生物菌群结构和微生物演替的鉴定。Moeun Lee等[40]通过Illumina MiSeq技术对韩国25份泡菜的微生物多样性进行分析，并发现不同样品泡菜微生物优势菌群较大，尤其在发酵初期，为泡菜的研发和质量控制提供基础。Alejandro等[41]通过454焦磷酸测序技术对奶酪的微生物多样性进行分析，比较了生牛乳、发酵乳清、凝乳和成熟奶酪的微生物菌群，发现生牛乳样品的细菌群落多样性最高，干酪、凝乳和乳清的多样性较低。Aregbe等[6]通过高通量16S技术分析了5种不同前处理的马铃薯产品的微生物多样性，得到魏氏菌属和酵母菌属为优势菌属，蒸发处理的马铃薯发酵产品中含有魏氏菌和葡萄糖乳杆菌，可降低pH值，抑制微生物的生长。杨春敏等[42]通过高通量16S和ITS分析了来自于海南的6份米酒酒曲的微生物菌群和结构，阐述了微生物群落与米酒的质量和风味关系。

2.3 多种技术联合的应用

由于每种微生物多样性研究方法的局限性和不足，为了更全面的了解发酵食品的微生物多样性和菌群特点，各种技术相结合在微生物多样性分析中很普遍。Deng等[43]通过传统方法对鲷鱼中的细菌、酵母和丝状真菌进行了计数，通过高通量16S和ITS测序技术对鲷鱼储藏50 d微生物多样性和菌群变化进行分析。Hou等[44]通过高通量测序技术分析了菜籽粕不同发酵条件微生物多样性，并通过传统方法分离鉴定了一株产热蛋白酶嗜热嗜硬脂杆菌，并发现在50%的含水量、55℃和24 h的发酵时间下，嗜热嗜硬脂杆菌的多肽产率最高（9.67%）。Li等[45]通过荧光原位杂交、下一代测序和化学分析等方法对茶饼发酵过程中微生物的丰度、菌群结构和化学成分进行了测定，发现发酵过程中微生物总数为每克样品2.310 2个～4.010 8个，以真菌为主。

3 展望

随着人们对微生物的研究越来越深入，以及分子生物学和生物信息技术的不断发展，为微生物多样性研究提供了更简便，快捷的方法，也加深了人们对发酵食品微生物群落的评估和理解。由于每种方法都有其局限性和不足之处，只有将多种方法相结合，才能更客观全面的了解发酵食品微生物多样性和菌群结构，这也将会成为未来发酵食品微生物研究的一个发展趋势。发酵食品微生物多样性研究将为益生菌的筛选、食品保鲜、延长货架期、提高产品附加值等提供理论基础，从而推动有关科学的发展。