熟地黄对视网膜损伤小鼠的影响

李丽维，王玥，周王谊，王艳华，刘垚杰，徐咏全，王浩*，杨志国

（1.天士力研究院，天津 300410；2.天津天士力（辽宁）制药有限责任公司，辽宁 阜新 123000；3.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

视疲劳又称为“眼疲劳综合征”或“眼疲劳”，为目前眼科常见的疾病之一，是一组表现为用眼后出现视觉障碍、眼部不适及全身症状以致不能正常进行视觉作业的症候群，是眼及全身器质性因素与精神心理因素相互交织的综合征[1]。根据临床调查，屈光未得到正确矫正和调节过度及光源亮度不充分、环境亮度不均匀等是产生视疲劳的主要原因，且现代医学分析其产生的根本原因可能为眼部产生的自由基得不到有效清除所造成的损伤进而导致视疲劳的发生[1-2]。晶状体是眼球中重要的屈光间质，对光线有屈光效果，具有过滤紫外线，保护视网膜的作用。晶体后面和玻璃体接触，光线通过晶状体后，通过玻璃体而到达视网膜，最终将捕获的光信号传至大脑。研究发现，晶状体与视疲劳之间具有密切的关系[3]。晶状体内没有血管，它所需的营养来自房水，当房水的代谢或晶状体囊出现问题时，原本透明的晶状体会变得不透明，最终影响视力，引起视疲劳及其它眼科疾病。现在缓解视疲劳的方法很多，但效果都不是十分理想。陈艳丽、谷炎培等研究显示过强的光照会引起视力的损伤，经常伴随色素紊乱[4]，并引起晶状体浑浊及皮肤光老化现象。桑传兰等[5]研究发现，过强的光照会使肝脏功能受损，其机制可能是因为过强的光照促使体内产生过量的活性氧自由基，引起蛋白质和脂质过氧化[6-7]，导致体内肝细胞受损。

熟地黄为生地黄的炮制加工品。熟地黄味甘，微温，归肝、肾经。具有补血滋明，益精填髓的功效，现代研究表明熟地黄具有抗氧化[8]、提高免疫力[9-10]，促进造血[11]，抗疲劳[12]等功能。熟地黄水提物及熟地黄多糖均为目前研究的热点，熟地黄水提液可提高谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，提高机体抗氧化能力[13]，研究发现熟地黄多糖同样具有抗氧化作用[14-15]，可显著提高血超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及GSH-Px活力水平，且剂量上呈现一定的量效关系[16]。熟地黄常与枸杞、菊花等联用于治疗眼疾，如经典名方杞菊地黄丸，现代研究也表明熟地黄与枸杞当归等复配汤剂具有缓解视疲劳[17]、抑制视网膜光感受器细胞损伤[18]、保护视网膜[19]等功效，而在眼科学研究方面以熟地黄单方为研究的相对较少。为了探究熟地黄对视疲劳的缓解作用，本研究以光损伤小鼠为模型，以熟地黄水提物及水提醇沉物为原料，通过检测晶状体与肝脏抗氧化指标来评价熟地黄对视疲劳的缓解作用。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

基础饲料、实验小鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD、CAT、GSHPx、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（AR＞99%）：上海麦克林生化科技有限公司；复方托吡卡胺滴眼液：参天制药（中国）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈阳兴齐眼药股份有限公司；LED灯：深圳市爱图仕影像器材有限公司；U-3900型紫外分光光度计：日本HITACHI公司。

1.2 熟地黄提取物来源

制备方法：称取熟地黄（符合2015版《中华人民共和国药典》标准），每次提取水量为熟地黄体积的6倍，提取3次，合并提取液，提取液浓缩得到水提物浸膏，将一部分水提物浸膏干燥制得熟地黄水提物，将另一部分水提物浸膏中加入适量乙醇，进行醇沉，收集沉淀物，干燥醇沉沉淀物制得熟地黄水提醇沉提取物（每克熟地黄水提取物与熟地黄水提醇沉提取物分别相当于熟地黄2.04 g与3.14 g）。

1.3 实验动物的选择

健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周龄，（18±1）g，许可证号为SCXK（京）2016—0002，饲养于实验动物中心[（23±2）℃，相对湿度55%～75%]。小鼠置于聚丙烯塑料笼中，每笼3只，每组2笼。动物房从早上7点至晚上7点给予正常光照，其余时间无光照，实验期间为动物提供充足的食物和水。本研究的所有实验程序均按照天津科技大学动物实验伦理委员会批准的方案进行。

1.4 光损伤模型制备及动物分组

动物适应一周后，实验分组，设立5个实验分组，分别为正常对照组（NOR），光损伤模型组（MOD），熟地黄水提醇沉提取物低（S1L）和高（S1H）剂量组，熟地黄水提取物组（S2），每组6只，期间采用灌胃方式分别对实验动物给药，根据前期预实验结果，NOR组和MOD组每天灌胃等量的溶媒，S1L组和S1H组给药剂量分别为每天360 mg/kg和450 mg/kg，S2组的给药剂量690 mg/kg（每天）。连续给药8周。喂养8周后，除NOR组外，其余4组小鼠在第9周开始，在（9 000±500）Lux光强下，每天照射4 h，连续照射 7 d，光照期间正常进食与饮水，光诱导损伤结束后，对小鼠相关指标进行检测。

1.5 体重及摄食量记录

体重及摄食量自给药开始后进行记录，其体重每周称量1次，共计8周，摄食量每天测量1次并记录。

1.6 晶状体中相关抗氧化能力的检测

小鼠在脱颈处死后立即摘取眼球，在高倍显微镜下，将晶状体从眼球中剥离出来，剥离过程在冰盘上进行。加入匀浆介质用匀浆器匀浆，4℃环境离心10 min（12 000 r/min），收取上清液，供待检测指标（GSH-Px、T-AOC）使用。各项步骤按试剂盒操作说明书上步骤进行。

1.7 肝组织中相关抗氧化能力指标检测

将小鼠体内取出的肝组织立即放入-80℃冰箱中保存，供检测生化指标（SOD、MDA、CAT、GSH-Px）使用。制备肝组织匀浆时，取出于低温保存的肝组织，按1∶9（g/mL）加冰生理盐水，在低温环境下用研磨棒将EP管中的肝组织研磨成组织匀浆。4℃、3 000 r/min低温高速离心机离心10 min，取上清液备用。各项指标根据试剂盒说明检测。

1.8 统计学分析

本实验统计方法采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，结果以±s表示，P＜0.05表示具有统计学差异。

2 结果分析

2.1 体重与摄食量

小鼠体重与摄食量见表1。

如表1所示，初始体重NOR、S1L、S1H和S2组与MOD组比较没有统计学差异（P＞0.05）。最终体重NOR、S1L、S1H、S2组较MOD组没有统计学差异（P＞0.05）。摄食量上看，NOR、S1L、S1H和S2组较MOD组没有统计学差异（P＞0.05）。

表1 体重与摄食量Table 1 Weight and food intake in each group

2.2 熟地黄提取物对晶状体抗氧化结果分析

熟地黄提取物对晶状体抗氧化结果分析见表2。

表2 各组晶状体抗氧化指标Table 2 Antioxidant index of lens in each group

如表 2所示，分析小鼠在（9 000±500）Lux的光强下，不同种类与剂量的熟地黄提取物对小鼠晶状体抗氧化能力的影响。从GSH-Px和T-AOC两个抗氧化指标上看，药物干预组抗氧化值高于模型组。与NOR组比较，给予光诱导损伤的小鼠其GSH-Px和T-AOC值均显著降低（P＜0.05）。与MOD组比较，S1L组和S1H组和S2组小鼠的GSH-Px和T-AOC值均显著升高，并具有统计学差异（P＜0.05）。

2.3 熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织中MDA含量的影响

熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织MDA含量的影响，结果如图1所示。

从图1结果上看，NOR组和MOD组的MDA含量分别为（0.8±0.1）nmol/mg prot和（1.6±0.15）nmol/mg prot，而摄入低和高剂量的熟地黄水提醇沉提取物和熟地黄水提取物后，与模型组相比，MDA含量分别下降16.88%、13.75%和12.5%，其中，与MOD组相比较，S1L组、S1H组和S2组均具有统计学差异（P＜0.05）。

图1 熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织MDA含量的影响Fig.1 Effects of the extract on MDA content in liver tissue of light-damaged mice

2.4 熟地黄提取物对小鼠肝组织中SOD活力的影响

熟地黄提取物对小鼠肝组织中SOD活力的影响，结果如图2所示。

图2 受试物对光损伤小鼠肝组织SOD活力的影响Fig.2 Effects of the extract on SOD activity in liver tissue of lightdamaged mice

图2结果显示，过强的光照导致肝组织中SOD活力降低，NOR 组 SOD 酶活力为（68.27±8.32）U/mgprot，而MOD 组为（34.95±5.28）U/mg prot，有显著性差异（P＜0.05），而S1L组、S1H组和S2组小鼠肝组织中的SOD活力较MOD组明显上升，分别提高79.44%、35.25%和20.03%。其中，与MOD组比较，S1L组、S1H组和S2组均具有统计学差异（P＜0.05）。

2.5 熟地黄提取物对小鼠肝组织中CAT活力的影响

熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织CAT活力的影响，结果如图3所示。

强的光照引起肝组织中CAT活力明显降低，NOR组（73.65±10.95）U/mg prot，而 MOD 组为（30.51±4.25）U/mg prot。药物干预组方面，与MOD组比较，S1L组、S1H组和S2组小鼠肝组织中的CAT活力明显上升，分别提高38.81%、45.12%和16.66%。与MOD组相比，熟地黄提取物各组均有统计学差异（P＜0.05）。

图3 熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织CAT活力的影响Fig.3 Effects of the extract on CAT activity of liver tissue in photoinjured mice

2.6 熟地黄提取物对肝组织中GSH-Px活力的影响

熟地黄提取物对肝组织中GSH-Px活力的影响，结果如图4所示。

图4 熟地黄提取物对光损伤小鼠肝组织GSH-Px活力的影响Fig.4 Effects of the extract on GSH-Px activity in liver tissue of light-damaged mice

图4实验结果显示，光损伤之后导致肝组织中GSH-Px活力明显降低，NOR组为（1 719.12±92.2）U/mg prot，MOD 组为（1 420±76.94）U/mg prot。药物干预组与MOD组比较，肝组织中的GSH-Px活力明显上升，S1L、S1H与S2组分别提高69.51%、19.44%和53.94%，与MOD组比较，S1L、S1H与S2组有统计学差异差异（P＜0.05）。

3 结论与讨论

熟地黄具有补血滋明，益精填髓的功效，有研究也发现以熟地黄为主要原料的杞菊地黄汤具有保护光感受细胞[20]、缓解视人体视疲劳[21]的作用，目前的研究发现熟地黄具有较强的抗氧化能力，这可能是其起到缓解视疲劳作用的机理之一，所以本课题通过研究2种熟地黄提取物对光损伤模型小鼠的晶状体与肝抗氧化指标，探讨熟地黄在缓解视疲劳方面的作用。光损伤动物实验评价发现，熟地黄水提物和水提醇沉物均能够明显减轻（9 000±500）Lux光强引起的氧化应激损伤，对小鼠的视力具有一定的改善作用。通过对小鼠晶状体中抗氧化能力的测定发现，熟地黄水提取物与水提醇沉提取物均可以明显提高GSH-Px和TAOC活力，且水提醇沉提取物在干预剂量的范围内随着剂量的升高其对晶体抗氧化效果也在增强。通过测定肝脏的抗氧化指标发现，2种熟地黄提取物均可以明显降低肝脏MDA含量，升高SOD、CAT和GSH-Px活力。这说明熟地黄提取物的抗氧化能力不仅体现在晶状体中，还可能体现在其它组织中，说明熟地黄提取物在体内具有抗氧化能力。由于晶状体的生理状态与视疲劳有密不可分的关系，提示2种熟地黄提取物均具有缓解视疲劳的功效。