WT1基因在监测急性髓细胞白血病微小残留病中的临床意义

许飞，李玲，马慧

（宁夏医科大学总医院 血液科，宁夏 银川 750004）

0 引言

急性髓细胞白血病（AML）是以异常分化的髓系细胞对骨髓，血液和其他组织的浸润为特征的血液系统恶性肿[1]。虽然目前AML的完全缓解率（CR）可达到60%-80%，然而之后仍存在较高的复发率。而微小残留病（MRD）是AML复发的主要原因，MRD 是指AML经化疗后或骨髓移植后体内残留微量白血病细胞。准确动态评估AML患者治疗后的MRD 对尽早预测复发、评价疗效、指导个体化治疗、有效地延长患者生存期均有重要意义[2]。同时进一步研究MRD特征性分子标志对监测MRD具有重要价值。WT1基因存在于11p13q染色体，其编码的转录因子通过参与造血干细胞正常分化与促进细胞异常过度增殖两个环节发挥重要作用。许多血液系统肿瘤及实体肿瘤均高表达WT1基因，特别是在白血病中，WT1基因的表达被作为白血病细胞存在的标志。同时，有研究报道WT1的mRNA表达水平与白血病疾病活动情况密切相关[3]。因此，本研究进一步探讨WT1的mRNA水平是否可以作为AML微小残留病的监测指标及其临床意义。

1 对象和方法

1.1 研究对象。2017年 6月至 2019年 6月宁夏医科大学总医院血液内科收治住院64例初发AML患者。所有AML患者均符合国际FAB诊断标准，经骨髓细胞形态学、免疫表型、细胞核型和分子生物学结果确诊。其FAB分型见表1。诱导治疗及缓解后治疗均参照成人急性髓细胞白血病诊疗指南[4]。经诱导缓解治疗后，其中46例患者达完全缓解，并进行长期随访，其中15例患者复发。通过多参数流式细胞术（MFC）检测完全缓解（CR）及每次巩固化疗后 MRD 水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），RT-PCR 检测每次巩固化疗后骨髓 WT1 基因表达水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），同时检测骨髓细胞形态学的变化。此外，所有患者均签署知情同意书并通过宁夏医科大学总医院伦理委员会批准。

1.2 WT1定量检测。抽取患者骨髓，用Ficoll分离骨髓单个核细胞，Trizol法提取总RNA，应用NanoDrop 2000分光光度仪检测RNA浓度及纯度，所有样本符合A260/A280 ≥1.8。取1ug RNA进行逆转录，并应用一步法RT-qPCR WT1试剂盒；反应条件：42摄氏度30分钟，94摄氏度变性5分钟，94摄氏度变性15秒，60摄氏度退火1分钟，循环40次。扩增反应在ABI 7500（美国Thermo Fisher公司产品）中进行，内参基因选用ABL基因。

1.3 MFC检测MRD。选择髓系抗原：CyMPO、CD13、CD33、CDw65、CD14、CD15、CD64、CD117等。取1×106个骨髓细胞与上述抗体在室温孵育15分钟，用氯化铵溶血后加生理盐水300G 5分钟离心洗涤一次，弃上清，用生理盐水悬浮细胞，并应用Cytomics™ FC-500 流式细胞仪进行检测。分析 CD45/SS 散点图的各群细胞抗原表达情况，取10000 个细胞，通过计算得出表达目标抗原的细胞之和所占细胞总数的百分比。本研究选取阈值为1%，MRD>1%为高水平，≤1%为低水平。

1.4 统计学处理。采用 SPSS 23．0 软件进行统计学分析。两组间WT1 mRNA水平比较应用独立样本t检验，率的比较用χ2检验，相关性分析应用Spearman相关系数，P<0.05 表示差异有统计学意义。

表1 64例AML患者的一般资料

2 结果

2.1 WT1 mRNA水平在AML患者初发、CR及复发期的变化。RT-qPCR证明WT1表达在初发AML患者中的表达明显高于CR及复发期表达水平（P<0.01），见图1；在AML各亚型间M3的WT1表达最高，且差异有统计学意义（P<0.01），见图2。

2.2 AML患者CR后骨髓MRD与WT1表达水平的相关性。对AML患者CR状态的骨髓行MRD及WT1基因表达水平相关性分析，结果提示二者呈正相关（r=0.47，P<0.01）。

图1 WT1 mRNA表达水平在AML初发患者、完全缓解及复发组中的差异

图2 WT1 mRNA表达水平在AML患者不同亚型（M1-M6）中的比较

2.3 联合动态监测AML患者CR后骨髓MRD及WT1表达水平与AML复发的关系。46例AML患者CR后，骨髓MRD与WT1任一水平增高组20例，复发11例（55%）骨髓MRD与WT1均水平降低组18例，复发2例（11%），两者复发率差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

WT1 基因于1990年被学者Call首次发现[5]，目前许多研究认为 WT1基因具有转录抑制及激活的双重作用，其能在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等实体肿瘤中的发病中发挥重要的作用[6]。之后的研究进一步发现WT1特殊的双向调控作用也参与了造血细胞的转录调控，并影响其增殖和分化，同时对造血细胞的凋亡也具有重要作用[7]。有文献报道WT1基因在幼稚细胞中高表达并抑制分化，具有癌基因特征。有学者报道初发AML患者中高表达WT1基因提示预后更差。

本研究发现，在初发AML患者中其WT1基因表达水平明显高于完全缓解期，且复发期较完全缓解也明显升高，说明WT1转录水平与AML临床缓解和复发有关，与Marjanovic等学者报道结果一致[8]。在AML各亚型之间，我们发现M3的WT1表达水平最高，而M1的表达水平最低，与YingChan等学者结果一致[9]。在进行AML患者MRD和WT1水平相关性分析发现两者呈正相关，对CR 后规律治疗的 46例患者进行 MRD及WT1 表达水平监测，发现 CR 期间 WT1 表达增高者复发率明显增高。进一步提示WT1基因表达可以在分子层面作为AML患者MRD的一项监测指标。因此应用RT-qPCR的方法检测WT1基因表达可作为MRD检测及AML疾病复发的标志，并根据 MRD 及 WT1 表达水平的变化及时调整治疗方案，给予有效的干预，可明显减低复发率，改善患者预后。

另一方面由于 WT1 基因在AML患者中高表达，以其作为治疗靶点的基因肿瘤疫苗也逐渐被人们关注和研究，现已有进入临床试验的相关肿瘤疫苗[10]，后续我们将进一步扩大样本量验证上述结果，同时在分子水平探讨WT1参与AML的发生机制。