胎盘生长因子荧光免疫层析法检测的临床性能评估

马锦琪，李 鹰，黄建荣，薛一峰，许亚丰，王春新*

1南京医科大学附属无锡人民医院产科，2医学检验科，江苏 无锡 214023

孕妇血清中的胎盘生长因子（placental growth factor，PlGF）是首个经过大规模临床验证的、可用于孕妇子痫前期预测及诊断的生物标志物［1-2］，PlGF浓度的变化与孕妇罹患子痫前期的风险密切相关。

目前，PlGF的检测技术有时间分辨荧光免疫分析、微流控、电化学发光法等［3-4］，这些技术都存在操作复杂或成本高昂等缺点。基于荧光免疫层析的检测方法操作便捷，成本低廉，可实现在临床门诊随到随诊，方便快速预测子痫前期的风险，具有较高的临床应用价值。

本研究建立了荧光免疫层析的PlGF检测方法，并对其分析性能与临床性能进行评价。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠抗人PlGF 单抗（克隆号：P616）和羊抗人PlGF 多抗（货号：CSB⁃DA217）（无锡金泰格生物科技有限公司）；重组人PlGF 蛋白（货号：TP723367，OriGene 公司，美国）；荧光微球（货号：FCEU002，规格：0.19 μm）（Bangs公司，美国）。对照试剂：胎盘生长因子检测试剂盒（电化学发光法，批号：21906701，Roche公司，德国）。荧光分析仪（广州蓝勃生物科技有限公司，型号：AFS⁃1000）；化学发光分析仪（Roche公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 反应体系的建立

1.2.1.1 抗体标记条件

抗体标记按荧光微球说明书进行，每毫克微球标记80～100 μg抗体。将微球与抗体（鼠抗人PlGF单抗）混合于pH为5.0～7.5的5种MES缓冲液（0.1 mol/L）中，放置室温，200 r/min摇床上反应2 h后于13 000 r/min 4 ℃离心30 min，取上清液测定残余抗体的量。

1.2.1.2 标记抗体与包被抗体用量

线性范围预设：20.0～9 000.0 pg/mL，按照表1的棋盘法，设置不同的标记抗体以及包被抗体（羊抗人PlGF 多抗）用量；组装PlGF 检测卡，采用0～10 000.0 pg/mL 的质控品进行检测，确立PlGF 标记抗体与包被抗体的最佳用量。

表1 棋盘法选择最佳的标记抗体与包被抗体用量Table 1 The optimal amounts of conjugated and coated antibody selected by checkerboard method

1.2.1.3 反应时间

在确定上述参数的基础上，采用定值质控品（500.0 pg/mL）摸索反应完成时间。

1.2.2 分析性能评价

参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）EP06、EP15、EP07 文件［7-9］和《WS/T 420⁃2013 临床实验室对商品化定量试剂盒分析性能的验证》［10-11］要求，对本项目建立的PlGF荧光免疫层析检测方法的分析性能进行评价，具体方法如下。

1.2.2.1 空白限

用空白质控品重复测定10次，计算信号值的平均值和标准差，得出平均值+2×标准差所对应的信号值，代入定标曲线方程计算对应的浓度值，即为空白限。

1.2.2.2 灵敏度（检出限）

参照行业标准［11］的方法，具体如下：预设灵敏度（检出限）为10.0 pg/mL，配制5份低值样本（10.0～20.0 pg/mL），每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序并与空白限进行比较，至少2 份样本的浓度高于空白限，则预设10.0 pg/mL 即为PlGF 检测方法的灵敏度（检出限）。

1.2.2.3 准确度（回收率）

将高浓度的PlGF样品A（11 045.0 pg/mL，10 μL）加入到空白质控品B（100 μL）中；重复测试3 次求平均值，根据以下公式计算回收率：（R）=［C×（V0+V）-C0×V0］/（V×Cs）×100%，式中R 为回收率；V 为样品A 液的体积；V0为样品B 液的体积；C为样品B 液加入A液后的检测浓度；C0为样品B液的浓度；Cs为样品A 液的浓度。参照行业标准［11］的要求，回收率应在85%～115%。

1.2.2.4 线性范围

参照行业标准［11］的方法，确立本项目PlGF荧光免疫层析检测方法的线性范围，具体方法如下：预设线性范围为20.0～9 000.0 pg/mL；将高浓度质控品（9 354.0 pg/mL）稀释至5个浓度，最低浓度应接近线性范围下限（20.0 pg/mL），每个浓度重复检测3次，计算平均值；计算检测浓度的均值与理论值的线性相关性，线性相关系数r应不低于0.990。

1.2.2.5 重复性

浓度分别为500.0、5 000.0 pg/mL 的PlGF 质控品各重复检测10 次，计算10 次测量结果的平均值和标准差，根据以下公式计算变异系数：CV（%）=标准差/平均值×100%。

1.2.2.6 干扰试验

交叉反应（特异性）：取重组血管内皮生长因子（VEGF）和重组表皮生长因子（EGF），加入至空白质控品及PlGF 高值血清，终浓度分别为200.0 ng/L 和3.0μg/L，重复测定3次计算均值。

干扰物质：取PlGF 高值血清，分别加入不同浓度的血红蛋白、总胆红素等可能的干扰物质，每个样本分别重复检测3次，计算平均值及干扰率，干扰率（%）=（干扰样本实测浓度-样本理论浓度）/样本理论浓度×100%。

1.2.3 临床性能评价

收集2018 年2—9 月来南京医科大学附属无锡人民医院就诊的136 例孕妇（年龄18～45 岁、孕周20～34+6周）的血清样本（不少于0.5 mL）；采集的血清在-20 ℃条件下冷冻保存，1个月内进行检测。每份血清样本均采用荧光免疫层析法与电化学发光试剂法平行检测，考察两种检测方法的相关性。

1.3 统计学方法

用SPSS17.0 和GraphPad Prism 5.0 软件进行数据处理与分析；两种检测方法结果的差异分析采用Bland⁃Altman检验，采用线性回归进行相关性分析，检验水准（α）为0.05。

2 结果

2.1 反应体系的建立

2.1.1 抗体标记的最佳条件

实验结果显示，当pH为6.5～7.0时，残余抗体最少（表2）；因此将抗体的标记pH确定为6.5～7.0。

表2 不同pH条件下抗体的标记效率Table 2 Conjugated efficiency of antibody with different pH condition

2.1.2 标记抗体与包被抗体用量

如图1 所示，配方2、配方4、配方5 符合线性范围的要求（即在20.0～9 000.0 pg/mL内，荧光信号值-浓度值的曲线接近于直线）；因此确定标记抗体的喷点量为3.5 μL/cm，包被抗体的用量为1.5 μg/μL。

2.1.3 反应时间

取质控品（500.0 pg/mL）80 μL 加入PlGF 检测卡，分别于5、10、15 min检测，重复3次求平均值，结果显示，检测卡在10 min时已完成反应（表3）；为确保反应充分，确立反应时间为15 min。

2.2 分析性能评价

2.2.1 空白限

图1 不同配方与信号值的对应关系Figure 1 Relation between different formulas and the sig⁃nal value

表3 不同反应时间后的检测结果Table 3 Test results after different reaction times（pg/mL）

空白质控品重复测定10 次，信号的平均值为0.052 3，标准差为0.002 5，根据均值+2×标准差，代入定标曲线方程计算得到PlGF 检测卡的空白限为6.08 pg/mL。

2.2.2 灵敏度（检测限）

根据实验结果，5 个低值样本的检测结果均高于空白限（6.08 pg/mL），确定PlGF 检测卡的灵敏度（检出限）为10.0 pg/mL（表4）。

2.2.3 准确度（回收率）

根据实验结果，确定PlGF 检测卡的准确度（回收率）为97.98%（表5）。

2.2.4 线性范围

以理论浓度为x轴，以实际检测浓度为y轴，考察相关性。结果显示，PlGF检测卡在16.7～9 000.0 pg/mL的线性相关系数r=0.999＞0.990，因此，确定PlGF检测卡的线性范围为20.0～9 000.0 pg/mL（表6、图2）。

2.2.5 重复性

根据实验结果（表7），PlGF浓度在500.00 pg/mL和5 000.0 pg/mL 时，检测卡的重复性（CV）分别为3.14%和2.98%。

2.2.6 干扰试验

交叉反应（特异性）实验结果显示，VEGF、EGF与PlGF 检测卡的交叉反应在-2.48%～3.95%，对检测结果无显著影响（表8）。

血红蛋白等干扰物质对检测结果的干扰率在-7.11%～-0.79%，其中，胆红素、类风湿因子和维生素C的干扰率均超过-5%，需引起重视，可作为本研究PlGF检测方法后继改进的内容之一（表9）。

表4 PlGF检测卡的灵敏度（检出限）Table 4 Sensitivity（limit of detection）of PlGF card （pg/mL）

表5 PlGF检测卡的准确度Table 5 Accuracy of PlGF card

表6 PlGF检测卡线性范围Table 6 Linear range of PlGF card

图2 PlGF检测卡的线性相关性Figure 2 Linear correlation of PLGF card

2.3 临床性能评价

2.3.1 两种检测方法的相关性分析

每个临床血清样本经荧光免疫层析法与对照方法平行测定，检测结果进行线性回归分析，结果如图3所示，两种PlGF检测方法具有良好的线性相关性：y=1.032x-5.002（r=0.991＞0.950）。

表7 PlGF检测卡重复性研究结果Table 7 Repeatability of PlGF card

表8 交叉反应对检测结果的影响Table 8 Influence of cross reaction on detection

2.3.2 两种检测方法的差异性分析

采用Bland⁃Altman 检验分析两种方法检测结果的差异，结果如图4 所示，荧光免疫层析法（考核系统）检测结果的平均值略高于电化学发光法（参比系统），但是两种检测方法的平均值差值仅为-8.98 pg/mL，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

先兆子痫是一种严重的妊娠并发症，通常发生在怀孕20 周以后。PlGF 浓度异常引起血管内皮功能障碍，是先兆子痫发生的重要原因［12-13］；检测血清中PlGF 水平的变化可显著提高先兆子痫诊断的准确性。

表9 干扰物质对检测结果的影响Table 9 Influence of interfering substances on detection

图3 荧光免疫层析法与电化学发光法的相关性Figure 3 Correlation between fluorescence immunochro⁃matography and electrochemiluminescence

图4 荧光免疫层析法与电化学发光法的差异分析Figure 4 Difference analysis of fluorescence immunochro⁃matography and electrochemiluminescence

PlGF现有的检测技术主要包括化学发光法、时间分辨免疫荧光法等；这些检测技术需要反复定标，依赖大型分析仪器，因此，往往是收集样本后集中检测，给临床诊疗带来了极大不便。2012年美国Alere公司推出了一款基于微流控技术的PlGF检测产品（Triage®PLGF），操作简便（滴加血清后15 min即可判读结果），性能优异，是目前临床应用最为广泛的PlGF 检测技术［14］。但微流控检测技术开发难度极大，全球实现量产的产品为数极少。近年来兴起的荧光免疫层析技术是一种快速免疫学检测方法［15-16］，具备与微流控相似的分析性能，灵敏度高，操作便捷，无需反复定标，综合成本更低，尤其适合现场检测，提高工作效率。

本研究基于荧光免疫层析技术建立PlGF 检测方法，包括抗体标记、包被、反应时间等关键参数的优化；同时依据CLSI 的EP6⁃A、EP15⁃A、EP7⁃A 等规范性文件，对荧光免疫层析检测方法的分析性能，包括空白限、灵敏度、准确度、线性范围、重复性和干扰试验进行了评价；最后，通过136例临床样本的检测，证实本项目建立的PlGF荧光免疫层析检测方法与电化学发光法具有良好的一致性。

综上所述，本研究应用荧光免疫层析技术，建立了血清中PlGF的检测方法，操作简便、快速，分析性能与临床性能优异。今后，我们将进一步改进这一检测技术，如降低类风湿因子等物质的干扰，通过与自动分析仪的适配研究实现自动化操作，使之更适合应用于临床子痫前期风险的评估。