外源ATP对油菜幼苗耐寒性的影响

2021-02-26胡馨丹张小花梁娟红张腾国

植物研究 2021年2期

胡馨丹李瑶张小花梁娟红张腾国

（西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）

低温是限制植物生长的关键非生物胁迫之一，是影响植物生长发育、地理分布和作物产量的重要环境因子［1］。植物在受到低温胁迫后会导致芽发育不良、叶片萎黄或泛黄以及组织死亡［2］。同时，在低温胁迫过程中，植物体内会产生大量活性氧（ROS），当生成量超过植物自身的清除能力时，ROS 开始攻击生物大分子，例如膜脂质、核酸和蛋白质，引起生物膜系统的损伤，导致光合产物的减少，代谢异常以及植物中有毒物质的大量积累［3～5］。耐寒性是植物抵御冷害的必要特性，特别是对于越冬作物［6］。为了增强植物在各种生物和非生物胁迫中的生命力，植物已经进化出一套复杂且精细的抗氧化系统抵御外部环境胁迫，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、愈创木酚过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX），以及其他自由基清除剂。除此之外，植物在响应低温胁迫过程中，各种有机和无机物质（如无机盐、脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和可溶性蛋白）通过渗透调节积累在植物细胞中，从而导致细胞液浓度增加和渗透势降低，进而减缓低温胁迫［7］。同时，Ca2+也参与耐寒调控过程，CPK 是Ca2+传感器，可以感知Ca2+单个蛋白质中的水平和激酶活性，对植物发育和植物对各种环境胁迫的反应至关重要。研究表明，Ca2+依赖性蛋白激酶（CPKs）参与低温胁迫下水稻的信号响应过程［8］。

ATP（三磷酸腺苷）不仅是所有生物的通用能源，而且还在细胞间通讯中充当重要的信号分子。20 世纪70 年代ATP 已被广泛接受为介导众多动物细胞过程的信号分子，包括神经传导、免疫应答、细胞生长和细胞死亡［9］。1970 年以后发现了ATP 在植物中可能发挥重要作用，Lew［10］等人发现外源施用ATP 可以促进根毛生长，并使生长中的根毛的质膜电位去极化；外源ATP 处理会引起根卷曲，并刺激侧根生长［11］。随着人们不断地研究发现，ATP 参与植物生长和发育的各种生理过程，包括植物生长，生物/非生物胁迫响应［12］。研究表明，外源施用或内源诱导的ATP 能够增强植物对盐［13］、寒冷［14］、干旱［15］等非生物胁迫的抗性。Feng［16］等研究发现，外源ATP 能够增强菜豆幼苗的叶绿素荧光参数。拟南芥中，外源ATP 能够通过清除ROS 促进根毛生长，表明ATP 能够调节与植物形态发生有关的氧化还原平衡［17］。此外，细胞外ATP（eATP）对植物的免疫响应具有一定的浓度依赖性，适宜浓度的eATP 能够增强植物对逆境的抗性［18～20］。Ca2+和H2O2是植物响应环境刺激诱导信号转导途径中的第二信使，也在外源ATP 调节植物细胞的生理功能中起作用。在应激信号转导过程中，Ca2+和H2O2与ATP之间既相互独立又存在交互作用［21］。研究表明，细胞外ATP 诱导的ROS 产生参与了各种植物的生长、发育和胁迫反应，例如防御反应，气孔运动和程序性细胞死亡［22～23］。ATP 通过调节Ca2+以及CaM 基因的表达进而增强枇杷的耐低温能力［24］；Ca2+和H2O2参与了外源ATP 对菜豆叶片的叶绿素荧光的调控［16］；外源ATP 能够通过增加H2O2和Ca2+浓度进而增强胡杨细胞的耐盐性［13］。虽然关于外源ATP 对植物抗逆性方面的研究有很多，但外源ATP 对油菜幼苗耐寒性方面的研究鲜见报道。

油菜作为我国第一大油料作物，其生产以冬油菜为主，但我国北方旱寒区冬季气候寒冷，严重影响了冬油菜在我国北方地区的种植［25］，白菜型冬油菜“陇油7 号”（Brassica campestris L.）是可以在中国北方安稳越冬的超强抗寒的冬油菜品种。本实验以“陇油7 号”为材料，探究了外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗丙二醛（MDA）、渗透调节物及活性氧的积累，光合能力以及抗氧化系统的影响，以及外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗RBO⁃HD、RBOHF、CPK4、CPK5 基因表达的影响，同时，还研究了Ca2+和H2O2是否参与了外源ATP缓解低温胁迫过程。研究结果为深入了解外源ATP 在植物抗逆过程中的生物学功能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以白菜型冬油菜“陇油7 号”为实验材料，种子由甘肃农业大学提供。

1.2 实验设计与处理

挑选出颗粒饱满，大小均一的油菜种子消毒后播种于装有等量混合营养土（营养土∶蛭石=2∶1）的花盆，置于25℃、光照强度为150 µmol·m-2·s-1、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）的培养间培养至4 周，挑选生长良好且长势一致的油菜幼苗进行以下处理：①低温胁迫：将油菜幼苗置于4℃的低温培养箱中处理24 h；②ATP+低温复合处理：用去离子水分别配置浓度为25µmol·L-1的ATP 溶液均匀喷洒在油菜幼苗叶片后，将油菜幼苗置于4℃条件下的低温培养箱处理24 h；③CaCl2/EGTA/H2O2/DMTU+低温复合处理：分别配制CaCl2（10 mmol·L-1）、EGTA（5 mmol·L-1）、H2O2（10 mmol·L-1）、DMTU（40 mmol·L-1）处理液分别均匀喷洒在油菜幼苗叶片后，将油菜幼苗置于4℃的低温培养箱中处理24 h；④DMTU/EGTA+ATP+低温复合处理：分别用40 mmol·L-1DMTU（H2O2清除剂）、5 mmol·L-1EGTA（钙离子螯合剂）浸泡油菜根部12 h 后，洗净油菜根部处理液，然后用去离子水配置的浓度为25 µmol·L-1的ATP 溶液均匀喷洒在经抑制剂处理过的油菜幼苗上，再将油菜幼苗转入4℃的低温培养箱中处理24 h。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 总叶绿素含量的测定

总叶绿素含量的测定采用Knudson［26］的方法。

1.3.2 叶绿素荧光参数测定

参照Demmig-Adams 等［27］的方法使用PAM-2500叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数。

1.3.3 生理指标测定

MDA含量的测定参照Heath［28］的方法；脯氨酸含量的测定参照Bates［29］的方法稍作改动；可溶性糖含量的测定参照郝建军等［30］的方法；O2-含量的分布采用NBT 组织化学染色法［31］，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT 显色法测定［32］；过氧化物酶（POD）活性的检测采用愈创木酚法［33］测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法测定［24］；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照Nakano［34］的方法测定；采用试剂盒测定总抗氧化酶（TAOC）活性和Ca2+-ATP 酶（Ca2+-ATPase）活性（购自南京建成生物工程研究所的试剂盒）。

1.3.4 实时荧光定量PCR 分析RBOHD、RBOHF、CPK4、CPK5基因表达

油菜叶片总RNA 的提取和cDNA 第一条链的合成，参照MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（Code No.9769）试剂盒（TaKaRa 公司）中的说明书进行。以提取到的油菜总RNA 为模板，以ActinF和ActinR 为管家基因引物，RBOHD-F、RBOHD-D为RBOHD 引物，RBOHF-F、RBOHF-D 为RBOHF引物，CPK4-F、CPK4-R 为CPK4 引物，CPK5-F、CPK5-R 为CPK5 引物，参照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ定量试剂盒（TaKaRa 公司）的说明书进行RT-PCR 反应，所有基因特异引物（见表1）由华大基因科技有限公司合成。每个样品均做3个平行，采用2−ΔΔCt法，其中：

式中：Ct 为荧光信号到达设定阈值时所经历的循坏数，计算基因相对表达量。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 20.0 软件进行统计分析，按单因素方差分析法在P＜0.05 水平上进行显著性检验，使用GraphPad Prism 5.01软件制图。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

2 结果与方法

2.1 外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗的积累及抗氧化酶活性的影响

如图1B-E 所示，与CK 相比，油菜幼苗叶片经外源ATP 处理后，SOD、POD、CAT、APX 四种抗氧化酶的活性无明显变化，经低温（4℃）处理24 h后，SOD、POD、CAT、APX 4 种抗氧化酶的活性显著增加，分别增加了63.9%、57.5%、88.9%、112.6%；与单独低温（4℃）处理相比，外源ATP+低温（4℃）复合处理下，SOD、POD、CAT、APX 4 种抗氧化酶的活性分别增加了14.1%、31.3%、44.3%、39.7%；结果表明，外源ATP 预处理能增加低温胁迫下油菜幼苗SOD、POD、CAT、APX 的活性，维持低温胁迫下ROS的平衡，增强油菜的耐寒性。

2.2 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗脯氨酸、可溶性糖含量的影响

如图2 所示，与CK 相比，外源ATP 处理后油菜幼苗叶片内的脯氨酸和可溶性糖的含量无显著增加，低温（4℃）处理24 h 后，油菜幼苗叶片内的脯氨酸和可溶性糖的含量显著增加，分别增加了51.9%、97.4%；与单独低温（4℃）相比，低温（4℃）+ATP 复合处理下脯氨酸和可溶性糖的含量显著增加，分别增加了40.2%、45.9%。结果表明，低温胁迫能够诱导油菜叶片渗透调节物质的显著升高，外源ATP 可以进一步提高低温胁迫下油菜叶片的渗透调节物质，增强油菜幼苗的耐寒性。

2.3 外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗叶绿素荧光参数的影响

Fv'/Fm'反应的是光适应下PSII 最大光化学效率，Y（II）反映的是光下叶片实际光化学效率，ETR反应的是电子传递速率，qP是光化学淬灭系数，表示的是PSII 中处于开放状态的反应中心所占比例。如图3A-D 所示，与CK 相比，外源ATP 处理对油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP无明显影响，但经低温（4℃）处理24 h 后油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP 显著下降，分别下降了34.5%、21.1%、36.9%和45.3%；与单独低温（4℃）相比，低温（4℃）+ATP 复合处理下油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP 分别升高54.8%、15.6%、36.9%和67.5%，且均差异显著。Y（NPQ）反应的是调节性能量耗散量子产量，NPQ 反映的是非光化学淬灭系数。如图3E、F 所示，与CK 相比，外源ATP 处理对油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 无明显影响，但经低温（4℃）处理24 h 后油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 显著增加，分别增加了88.5%、25.7%；与单独低温（4℃）相比，低温（4℃）+ATP 复合处理下油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 分别下降了31.8%、67.5%，且均差异显著。结果表明，外源ATP 预处理能够缓解低温胁迫下油菜幼苗光化学反应效率的降低。

2.4 外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗丙二醛和总叶绿素含量的影响

如图4A所示，与CK相比，低温（4℃）处理24 h后油菜幼苗MDA 含量显著升高；经ATP 预处理再低温（4℃）胁迫与单独低温（4℃）处理相比油菜幼苗MDA 含量降低了21.2%；与ATP+低温（4℃）复合处理相比，用ATP+DMTU 预处理后在低温胁迫处理的黄瓜幼苗MDA 含量增加了22.7%，用ATP+EGTA 预处理后在低温胁迫处理的黄瓜幼苗MDA含量增加了19.4%，且均差异显著，说明低温胁迫能够促进油菜幼苗MDA 含量增加，而外源ATP 预处理可以抑制低温胁迫下油菜幼苗MDA 含量增加，缓解低温胁迫下油菜幼苗的膜脂损伤，而DMTU 和EGTA 可以抑制外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗膜脂损伤的缓解。

如图4B所示，与CK 相比，低温（4℃）处理24 h后油菜幼苗总叶绿素含量显著降低；经ATP 预处理再低温（4℃）胁迫与单独低温（4℃）处理相比油菜幼苗总叶绿素含量升高了127.6%；与ATP+低温（4℃）复合处理相比，用ATP+DMTU 预处理后在低温（4℃）胁迫处理的黄瓜幼苗总叶绿素含量降低了26.7%，用ATP+EGTA 预处理后在低温（4℃）胁迫处理的黄瓜幼苗总叶绿素含量降低了32.6%，且均差异显著，说明低温胁迫能够导致油菜幼苗总叶绿素含量降低，外源ATP 预处理可以促进低温胁迫下油菜幼苗总叶绿素含量增加，缓解低温胁迫下油菜幼苗的损伤，而DMTU 和EGTA 可以抑制外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗损伤的缓解，表明H2O2和Ca2+可能参与了ATP 诱导油菜幼苗的耐寒性的过程。

2.5 外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗RBOHD、RBOHF基因表达和总抗氧化酶活性的影响

如图5A、B 所示，单独低温（4℃）处理下，油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表达显著上调分别是CK的2.32倍、3.53倍；与单独低温（4℃）处理相比，低温（4℃）+ATP 复合处理下和低温（4℃）+Ca2+复合处理下油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表达显著上调，而低温（4℃）+EGTA 复合处理下RBOHD和RBOHF 基因表达明显下调；表明外源ATP 和Ca2+预处理均能够增强低温诱导下油菜幼苗RBO⁃HD和RBOHF基因表达；与低温（4℃）+ATP处理相比，经低温（4℃）+ATP+EGTA 复合处理后油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表达显著下调，说明外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗的RBOHD 和RBO⁃HF基因表达的影响可能与Ca2+有关。

如图5C 所示，与单独低温（4℃）处理相比，外源ATP 预处理再低温（4℃）胁迫与Ca2+预处理再低温（4℃）胁迫均显著提高了T-AOC 酶活性，而经EGTA 预处理后再进行低温（4℃）胁迫，T-AOC 酶活性显著降低；与低温（4℃）+ATP 复合处理相比，低温（4℃）+EGTA+ATP 复合处理显著降低了油菜幼苗的T-AOC 酶活性，说明外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗的T-AOC 酶活性的影响可能与Ca2+有关。

2.6 外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗CPK4、CPK5基因表达和Ca2+-ATPase活性的影响

如图6A～B 所示，单独低温（4℃）处理下，油菜幼苗的CPK4 和CPK5 基因表达显著上调，分别是CK 的4.28、6.94 倍；与单独低温（4℃）处理相比，经外源ATP 预处理或H2O2预处理再低温（4℃）胁迫能够诱导油菜幼苗CPK4和CPK5基因表达显著上调，而低温（4℃）+DMTU复合处理下CPK4和CPK5的基因表达显著下调，表明外源ATP 和H2O2均可以诱导低温胁迫下油菜幼苗CPK4和CPK5基因表达；与低温（4℃）+ATP 处理相比，低温（4℃）+DMTU+ATP 处理后的油菜幼苗CPK4 和CPK5 基因的表达水平显著下调。说明外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗的CPK4和CPK5基因表达的影响可能与H2O2有关。

如图6C 所示，与单独低温（4℃）相比，DMTU预处理后再低温胁迫下的油菜幼苗Ca2+-ATPase酶活性显著下降，而外源H2O2预处理在低温胁迫明显提高了油菜幼苗的Ca2+-ATPase 酶活性，与低温（4℃）+ATP 复合处理相比，低温（4℃）+EGTA+ATP复合处理显著降低了油菜幼苗的Ca2+-ATPase酶活性。说明外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗的Ca2+-ATPase酶活性的影响可能与H2O2有关。

3 讨论

植物在遭受低温胁迫时，会产生大量ROS，导致膜脂过氧化、蛋白质活性降低甚至丧失、代谢紊乱等。近年来研究发现，低温胁迫能够使樱桃、番茄、油菜、水稻幼苗中抗氧化酶活性增强、渗透调节物质含量升高、MDA含量降低，导致植物受到损伤［35～37］。同时，Huo［15，38］等研究发现，外源ATP能够通过调节MDA 含量、抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，进而增强非生物胁迫下植株幼苗的耐受性，本实验结果与这些报道相一致。本研究发现，外源ATP能够显著抑制低温胁迫下油菜幼苗MDA含量的增加、促进脯氨酸、可溶性糖含量的积累和SOD、POD、CAT、APX 活性的升高，表明外源ATP能够通过调节低温胁迫下油菜幼苗的渗透调节物质和抗氧化能力缓解质膜损伤，增强油菜幼苗的耐寒性。

光合作用是大多数植物正常生长发育的必要条件，逆境胁迫能够导致植物叶绿素的合成以及有机物积累能力下降，造成植物产量降低甚至绝产。在本研究中，低温胁迫下油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（Ⅱ）、ETR、qP参数显著低于对照处理，Y（NPQ）、NPQ 参数明显高于对照处理。这与低温胁迫对水稻、黄瓜、甘蔗、香蕉等植株光合作用相关参数的影响相一致［39～40］。此外，也有研究表明，外源ATP处理能显著提高病原菌感染下菜豆幼苗的光合速率［41］。本研究中，外源ATP 能提高低温胁迫下Fv'/Fm'、Y（Ⅱ）、ETR、qP参数，降低低温胁迫下Y（NPQ）、NPQ 参数，表明外源ATP 能够通过调节低温胁迫下油菜幼苗光合色素积累和光合效率的提高，进而提高油菜幼苗的耐寒性。

Ca2+和H2O2作为植物激素信号和植物对逆境应激反应过程中的信号分子，响应低温和盐等非生物胁迫［42～43］。植物NADPH 氧化酶被认为是H2O2的主要生产者，近几年研究发现，低温胁迫能够诱导油菜幼苗RbohC和RbohF基因的表达［44］；外源ATP 通过刺激NADPH 氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡［45］。结合这些前人结果，本研究中，DMTU 预处理显著降低外源ATP 对低温胁迫下油菜幼苗MDA 含量的抑制和总叶绿素含量的增加，可能是由于H2O2参与外源ATP 对油菜幼苗耐寒性调控过程。CPK 是Ca2+传感器，感知Ca2+单个蛋白质中的水平和激酶活性，对植物生长发育和应对各种环境胁迫至关重要。OsCPKs 能被低温胁迫迅速激活，是水稻响应低温胁迫过程中的必需基因［46］。同时，Jeter［47］等研究发现，外源ATP 能够诱导拟南芥幼苗Ca2+浓度的增加。本研究表明，EGTA 预处理显著降低外源ATP 对低温胁迫下MDA含量的抑制和总叶绿素含量的增加，可能是由于Ca2+参与外源ATP 对油菜幼苗耐寒性调控过程。本实验中，EGTA 或DMTU 预处理油菜幼苗均能降低外源ATP 对低温胁迫下T-AOC 酶、Ca2+-ATPase酶的活性和RBOHD、RBOHF、CPK4 和CPK5 基因的表达，这与前人研究结果相一致［48～49］。以上结果表明Ca2+和H2O2均参与外源ATP 诱导油菜耐寒性的调控过程，并通过Ca2+和H2O2依赖性机制影响油菜幼苗的耐寒性。