大蒜素改善脑出血大鼠神经功能的机制研究

李永召

脑出血是指非外伤脑实质内血管破裂所引发的出血，是神经系统领域内常见的疾病之一，具有较高的发病率和致死率[1,2]。脑出血后，出血灶周围组织缺血、缺氧，造成炎性因子和多种因子大量释放，脑水肿、氧化应激等连锁反应引起脑组织继发性损害，使脑出血患者的神经细胞功能严重受损[3,4]。有研究表明，脑出血后受损的神经元轴突有一定的再生与修复能力[5]，此研究对临床中脑出血患者神经功能的恢复提供了新的治疗靶点[6]。大蒜素是从葱科葱属植物大蒜中提取的一种有机硫化合物，临床上用于深部真菌和细菌感染及隐球菌性脑膜炎和肺结核的治疗[7]，大蒜素同时具有消炎[8]、降血脂、降血压、降血糖[9]及抗心律失常的药理作用。大蒜素能改善脑缺血再灌注损伤，但有关大蒜素对脑出血损伤的研究笔者所见尚不多。本实验通过胶原酶法制备脑出血大鼠模型，观察大蒜素对脑出血大鼠神经功能的作用，并探讨其促进脑出血后轴突再生的影响，从而为大蒜素的临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:雄性SD大鼠60只，SPF级，体重180～200 g，年龄6～8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011。

1.1.2 药物与试剂:大蒜素(西安天瑞生物技术有限公司，批号：201933282)；大鼠神经丝蛋白200(NF200)小鼠单克隆抗体(Merck公司，批号：N5389)、微管相关蛋白-2(MAP-2)兔多克隆抗体(Abcam公司，批号：ab32454)、髓鞘碱性蛋白(MBP)兔多克隆抗体(Abcam公司，批号：ab40390)、生长相关蛋白(GAP43)兔多克隆抗体(Abcam公司，批号：ab11136)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)兔多克隆抗体(Abcam公司，批号：ab3760)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)小鼠单克隆抗体(Abcam公司，批号：ab93926)。

1.2 方法

1.2.1 采用胶原酶法制备脑出血大鼠模型：根据参考文献[10]，实验动物以10%水合氯醛腹腔麻醉，俯卧位固定在大鼠脑立体定向仪，皮肤消毒，暴露颅骨前囟点，在手术显微下用牙科钻钻孔，用小号直纹钳开约2 mm 直径小颅窗，用微量进样器向右侧尾壳核处缓慢注入2 μl 0.5 U胶原酶，留针10 min后，缓慢退出，钻孔用骨蜡封闭，逐层缝合后回笼饲养，室温控制在25℃左右。假手术组大鼠注射0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 分组与给药:60只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、大蒜素低、中、高剂量组(15、30、60 mg/kg)，每组12只。术后30 min进行腹腔注射给药，假手术组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液，以上均以1 ml/100 g给药。

1.2.3 神经功能评分:给药24 h后按Zea Longa评分法测定行为学变化。根据Zea Longa 推荐的五级制评分，并稍作改进，对大鼠神经功能进行评分：0分：正常，无神经损伤症状；1 分：对侧前爪部分屈曲或完全屈曲；2分：向偏瘫侧轻度转圈；3 分：向偏瘫侧明显转圈；4 分：向偏瘫侧倾倒；5分：不能自发行走，意识丧失。

1.2.4 脑组织含水量:行为学结束后，麻醉大鼠，每组取6只大鼠，快速断头取脑组织，去掉嗅球、小脑和低位脑干后，分别称量脑湿重，再置于烘箱中，70℃烘烤24 h至恒重，精确称量干重，按如下公式计算脑组织含水量。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.5 HE染色:每组取3只大鼠，脑组织取材，固定于甲醛，24 h 后做石蜡切片，常规HE染色，显微镜下观察脑组织的病理变化。

1.2.6 Western-blot方法检测大鼠脑组织蛋白表达水平:每组取3只大鼠，取大鼠脑出血灶周围组织，至于液氮中保存。大鼠脑组织，用组织裂解液冰浴中，充分匀浆，离心，使用酶标仪检测脑组织蛋白浓度。按照说明书配制聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白样本变性分离，转移至PVDF膜，将膜在脱脂奶粉溶液中孵育，加入NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β一抗或内参GAPDH进行抗原抗体结合(稀释度：1∶500)，加入相应的二抗于摇床上充分孵育结合，洗膜后用X胶片采用化学发光方法进行曝光显影，用蛋白分析软件将X胶片扫描后的图片灰度值进行分析，以内参灰度值校正，以NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β/GAPDH灰度值比值代表目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 大蒜素对脑出血大鼠神经功能评分的影响 与假手术组比较，模型组神经功能评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素低、中、高剂组神经功能评分明显降低(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 5组大鼠神经功能评分比较 n=12,分,

2.2 大蒜素对脑出血大鼠脑含水量的影响 与假手术组比较，模型组脑含水量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素低、中、高剂组脑含水量明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 5组大鼠脑含水量比较

2.3 大蒜素对脑出血大鼠病理损伤的影响 假手术组大鼠脑组织光镜下可见，神经细胞排列有序、细胞核呈椭圆形，核大，均匀规则；模型组可见细胞排列紊乱，水肿明显，细胞核固缩；大蒜素组病理损伤比模型组明显减轻。见图1。

假手术组 模型组 大蒜素低剂量组 大蒜素中剂量组 大蒜素高剂量组

2.4 大蒜素对脑出血大鼠NF200、MAP-2、MBP、GAP43表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表达下降(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素低剂组 MAP-2、MBP、GAP43表达上升(P<0.05或<0.01)，大蒜素中、高剂组NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表达上升(P<0.05或<0.01)。见表3，图2。

表3 5组大鼠脑组织NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表达的变化

图2 5组大鼠脑组织NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表达的Western-blot检测；1 假手术组；2 模型组；3 大蒜素低剂量组；4 大蒜素中剂量组；5 大蒜素高剂量组

2.5 大蒜素对脑出血大鼠AMPKα、GSK-3β表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织AMPKα、GSK-3β蛋白表达上升(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素低剂组GSK-3β蛋白表达下降(P<0.05)，大蒜素中、高剂组AMPKα、GSK-3β蛋白表达下降(P<0.01)。见表4，图3。

图3 5组大鼠脑组织AMPKα、GSK-3β表达的Western-blot检测；1 假手术组；2 模型组；3 大蒜素低剂量组；4 大蒜素中剂量组；5 大蒜素高剂量组

表4 5组大鼠脑组织AMPKα、GSK-3β蛋白表达变化

3 讨论

大蒜素是一种广谱抗菌药，临床上主要用于深部真菌和细菌感染，同时大蒜素具有降血压、降血脂、抗肿瘤、抗氧化及提高免疫力等多种生物学功能。大蒜素对脑损伤的实验研究也有大量报道，Shao等[11]报道了大蒜素能够减轻脑水肿、抑制氧化应激损伤和细胞凋亡，改善实验性蛛网膜下腔出血大鼠神经功能；李春艳等[12]报道了大蒜素能够抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注后的血液流变学改变，对脑缺血损伤大鼠具有良好的保护作用。本研究采用胶原酶法制备脑出血大鼠模型，我们观察到脑出血大鼠神经功能评分明显升高，神经功能严重受损，脑水肿含量亦明显升高，给予大蒜素干预后，神经功能评分和脑含水量明显降低，同时HE染色也显示了大蒜素能改善脑出血大鼠脑组织的病理损伤，表明大蒜素能够减轻脑水肿，改善神经功能，对脑出血大鼠有很好的保护作用。

大脑神经元在死亡后几乎无法再生，但已有报道神经元轴突有一定的再生与修复能力，可帮助脑出血患者的神经功能得到一定的恢复[13]。目前研究最多的神经元轴突相关蛋白有神经丝蛋白NF200、微管相关蛋白MAP-2、髓鞘碱性蛋白MBP等[14,15]。NF200是构成神经细胞轴突中间丝的蛋白质，可以反映轴突的生长情况，是神经元轴突标记物，与微管和微丝一起形成神经元细胞骨架[16]；MAP-2是微管相关蛋白，与NF200共同参与细胞骨架形成及轴突发生，影响神经传导速度[17]；MBP是神经系统少突细胞和周围神经系统雪旺细胞合成的一种强碱性膜蛋白，是判断中枢神经系统破坏程度的重要指标[18]；GAP43蛋白与神经元轴突的生长以及突触可塑性密切相关[19,20]。本研究观察到脑出血大鼠出血部位NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表达明显降低，给予大蒜素治疗后，能显著提高NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表达，表明大蒜素能够促进脑出血后轴突再生。

为进一步研究大蒜素对脑出血后轴突再生的机制，我们对AMPK/GSK-3β信号通路进行了检测。AMPK是调节生物能量代谢的重要分子，是代谢研究中的核心因子参与脑细胞的代谢。GSK-3β作为信号蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡，已有研究报道了降低GSK-3β活性可调控细胞骨架，促进微管稳定性，增加轴突的再生[21]。本研究结果显示脑出血后AMPK和GSK-3β表达下降，AMPK/GSK-3β信号通路下调，大蒜素能明显上调AMPK/GSK-3β通路，结合上述的轴突再生相关蛋白NF200、MAP-2、MBP和GAP43表达上升，表明大蒜素干预后，可以降低脑组织AMPK水平，抑制神经元GSK-3β活性，提高轴突再生相关蛋白表达，促进轴突再生，改善脑出血大鼠神经功能，发挥其脑组织保护的作用。