健肝乐颗粒对大鼠肝纤维化模型的保护作用及相关机制*

余爱红 晏红星

1.湖北省黄冈市黄州区人民医院药剂科 (湖北 黄冈， 438000) 2.湖北省黄冈市食品药品检验检测中心

肝纤维化是多种因素导致的肝细胞炎症产生和细胞坏死，进一步导致细胞外基质沉积和细胞因子失衡，并刺激肝纤维细胞生成的病理性过程。是慢性肝损伤向肝硬化发展的必经阶段[1]。四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化[2]，是目前研究肝纤维化最常用的模型，适用于药物治疗肝纤维化的药理学研究。

健肝乐颗粒中含有白芍和甘草，处方源自于经典名方“芍药甘草汤”。有现代研究报道，甘草酸类制剂可以作为保肝药物治疗肝病，其主要的作用成分是甘草酸和甘草苷[3,4]。芍药多苷作为中药白芍提取度最高且起治疗作用活性成分[5,6]，同时芍药苷也是健肝乐颗粒检测主要成分，芍药苷具有多种生物学活性且不良反应小。本研究旨在明确健肝乐颗粒抗肝纤维化的药效机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级的SD大鼠50只，体重220～250 g，雌雄各半，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 药品、试剂与仪器 健肝乐颗粒由武汉康乐药业股份有限公司提供，CCl4由江苏强盛功能化学股份有限公司提供；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX、TNF-α、IL-1β、HA、LN、HYP等试剂盒由武汉科瑞生物技术有限公司提供。应用ESJ120-4电子天平，PTT-A600电子天平，XHF-D高速分散器，TG-16W台式高速离心机，TDL-5A低速大容量离心机，Biotek Eon微孔板分光光度计等仪器设备。

1.3 建立肝纤维化的动物模型及干预方法 将50只大鼠计算机随机分成5组，为正常组，模型组，健肝乐高、中、低剂量组，每组10只。除正常组给予相应剂量花生油外，其余4组于大鼠背部给予50% CCl4(0.2 ml/100 g)皮下注射。1周造模处理2次，连续12周。正常组和模型组在造模第5周起，进行蒸馏水灌胃处理，健肝乐低、中、高剂量组进行受试药灌胃，1次/d，持续给药8周。

1.4 检测指标及方法 眼眶静脉丛采血，测定血清中ALT、AST、TNF-α、IL-1β、HA、LN水平。颈椎脱臼处死SD大鼠，精确称取大鼠肝、肾、脾三个脏器和胸腺的重量，并计算脏器指数。用分光光度法测定肝组织匀浆HYP、TNF-α、MDA的含量，以及SOD和GSH-PX活性[7]。并在同一部位切取肝脏组织，石蜡切片制备过程采用4%的甲醛进行固定。采用HE染色，在光镜下进行组织病理学观察[8]。

2 结果

2.1 5组大鼠体重和死亡率比较 模型组大鼠与正常组大鼠比较，12周后的体质量增长值降低明显，差异有统计意义(P<0.05)，各受试组的体重变化与模型组比较差异无统计学意义。实验死亡率分析发现，健肝乐高、中剂量组死亡率差异无统计学意义(P>0.05)。健肝乐低剂量组与正常组的死亡率为0，低于其他受试组，表明健肝乐对动物的损伤较轻，同时在合适剂量时，具有明显的肝、肾、脾保护作用，可以修复大鼠机体损伤，降低死亡率。见表1。

2.2 5组大鼠脏器指数比较 见表2。

2.3 5组大鼠血清生化指标比较 健肝乐中、低剂量组在降低ALT、AST具有明显的优势；在降低IL-1β、HA、LN、HYP指标中，健肝乐中、低剂量组较模型组具有明显改善作用。见表3。

2.4 5组大鼠肝组织中SOD、GSH-PX的活性与TNF-α、MDA的比较 见表4。

2.5 肝组织切片HE染色结果 见图1，正常组大鼠肝小叶脉路清晰组织完整，细胞有序排布。细胞无损伤，细胞核呈圆形，位于细胞中央。模型组大鼠肝小叶脉路模糊组织不完整，肝细胞混乱无序。肝细胞损伤，伴随有一定程度的肝细胞变性和点片状坏死。与人体产生的肝纤维化相类似，细胞外基质(ECM)和胶原纤维增多，在部分区域出现炎症细胞浸润[9]。通过药物干预，健肝乐中、低剂量组大鼠肝组织的炎性浸润、纤维增生和病灶坏死明显少于模型组大鼠。

3 讨论

肝纤维化相关研究证明，纤维化形成原因与肝细胞的氧化应激和细胞膜上的脂质过氧化相关，抗纤维化的药物作用机制与抗氧化密切联系。转氨酶主要存在于肝细胞中，当肝细胞破损或受外界刺激时，肝内容物进入血液，导致血清中转氨酶异常升高。因此临床治疗肝功能异常以转氨酶指标变化作为的主要的疗效参考指标之一。而SOD和GSH-PX两种酶的活性强弱，反映了机体抗氧化清除氧自由基的能力[10]。肝纤维化是由于ECM的分泌和代谢失衡、肝细胞氧化和抗氧化的失衡，导致ECM在肝内大量堆积，刺激肝星状细胞(HSC)及胶原增多。因此HSC的激活、ECM沉积与基质降解能力下降是肝纤维化形成的关键因素[11]。而氧化应激能促使HSC的活化，转化成为纤维细胞以及纤维细胞的大量合成。肝脏胶原纤维和血清中分别含有HYP、HA，二者的含量变化可反映肝纤维的活动状态和纤维化程度；肝窦毛细血管化和ECM在汇管区的增生，都影响到LN的合成分泌；三者可较敏感地反映肝纤维化的情况[12]。同时，据最新研究报道，肝纤维化的形成还与肝细胞因子有关，肝纤维化引起细胞因子TNF-α、IL-1β水平升高；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量能影响HSC的活化，降低α-SMA的含量能可有效抑制肝纤维化[13]。

图1 实验大鼠肝组织切片(HE染色)

健肝乐颗粒白芍和甘草组方，来源于东汉医圣张仲景的经典名方“芍药甘草汤”，原方具有缓急止痛、柔肝舒筋的功效[14]。健肝乐颗粒则是根据中医理论进行随症加减，并运用现代制药工艺精制成药，在保留原方缓急止痛功效之外，还增强了芍药的养血护肝的效力，广泛应用于各种原因引起的肝功能异常的临床治疗[15]。上述药效学实验研究结果表明，健肝乐颗粒能够增强SOD、GSH-PX活性，提高肝细胞抗氧化的能力，减轻肝损伤产生MDA，同时通过调节TNFα、IL-1β等细胞因子的表达，改善ECM的异常增生，减少基质堆积和HSC的活化，达到逆转肝纤维化的效果；健肝乐颗粒在抗氧化能力和改善肝纤维化各项生理指标效果方面，具有明显的治疗优势。以上研究结果为健肝乐颗粒在肝纤维化疾病中的开发和临床应用提供了药理实验依据。