SDC2甲基化基因在结直肠癌组织中表达的临床意义分析

梁霞，李锦，伍文

结直肠癌(CRC)的发病率居各类恶性肿瘤发病率和病死率的第3位和第2位[1-2]，越来越多的证据表明CRC的发生发展是一个多因素、多阶段和多基因改变的复杂病变过程[3]；CRC早期缺乏典型的临床症状和体征，大多数患者确诊时已经是中晚期，大多数生存期<5年，错失了最佳临床治疗时机，因此在临床上应对CRC早期诊断，积极采取早治疗的临床措施[4]。癌胚抗原(CEA)和糖蛋白抗原19-9(CA19-9)都是CRC比较常用的肿瘤标志物，但CEA和CA19-9应用仍存在灵敏度较低等问题[5-6]；基因甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式，特定基因的甲基化可作为恶性肿瘤发生、发展的标志[7]；多配体蛋白聚糖2(SDC2)家族是硫酸肝素蛋白聚糖中的成员，有研究证实，SDC2异常甲基化与肿瘤的发生及发展密切相关[8]。本研究旨在分析SDC2在结肠癌发生及发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年5月-2019年10月深圳市宝安区中心医院/深圳大学第五附属医院就诊治疗的原发性CRC患者56例，男36例，女20例，年龄43～85(52.20±8.47)岁。所有患者均由医院住院部术前活检或术后病理学确诊，纳入标准：(1)第8版内科学中结直肠癌的诊断标准[9]；(2)初次诊断为CRC；(3)不合并影响CRC的其他疾病；(4)无消化系统畸形；(5)无手术史；(6)未经过任何针对肿瘤的治疗；(7)临床资料完整。排除标准：(1)物质滥用或依赖者；(2)不同意参与或中途退出本研究者；(3)对本研究所用药物过敏者；(4)各种原因引起的凝血功能障碍者；(5)妊娠患者；(6)同时合并其他肿瘤。其中把CRC患者的肿瘤组织设为A组及其癌旁正常组织设为B组，按根据国际抗癌联盟标准对A组进行TNM分期分组[10]：Ⅰ期为T1亚组10例，Ⅱ期为T2亚组12例，Ⅲ期为T3亚组18例，Ⅳ期为T4亚组16例；另随机选取同期医院进行健康体检者50例作为对照组，男25例，女25例，年龄43～85(51.95±8.51)岁。各组研究对象一般临床资料(如年龄和性别)均无统计学差异(P>0.05)。本研究获得医院医学伦理委员会审核并批准，所有入组患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA的检测：DNA抽提、反转录和逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)均按照Trizol试剂盒说明书抽提A组结直肠癌组织、B组癌旁正常组织和对照组正常组织的SDC2甲基化DNA。采用广州市康立明生物科技有限责任公司的SDC2甲基化DNA试剂盒反转录合成cDNA，应用ABI公司PRISM 7500 RT-PCR系统，以β-actin为内参照检测各组组织的SDC2甲基化DNA的相对表达量。

1.2.2 CEA和CA199检测：使用化学发光法，其检测仪器为美国贝克曼库尔特UniCel DxI 800型全自动化学发光免疫分析仪，其配套试剂为美国贝克曼库尔特厂家配套检测试剂盒，详细步骤均参照试剂说明书，将20 mg组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨60次，加入200 μl天然细胞裂解液(SN-002)，继续研磨60次；开盖冰上孵育5 min，盖上盖子，4 ℃，16 000×g离心15 min取出，收集管里的上清备检。

2 结 果

2.1 各组SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表达情况 A组的SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9均高于B组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；B组的SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表达情况

2.2 TNM分期SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表达情况 T1、T2、T3、T4亚组中的组织中SDC2甲基化基因、CEA、CA19-9表达分布差异有统计学意义(P<0.05)，T1、T2、T3、T4亚组中的组织中SDC2甲基化基因、CEA、CA19-9相对表达量逐渐升高。见表2。

表2 TNM分期SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表达情况

2.3 灵敏度和特异比较 SDC2甲基化基因在CRC诊断的灵敏度和特异性均高于CEA、CA19-9及CEA联合CA19-9，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9在的灵敏度和特异性比较 (%，n=56)

3 讨 论

近年来我国CRC的发病率显著性提高，起病隐匿早期症状不典型，多数患者确诊时处于中晚期，其疗效差预后不良，目前CRC还未有一种肿瘤标志物是绝对特异性的，严重威胁着国民的生命健康[11]。CRC的癌变及侵袭是多种因素共同作用的后果，高DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的重要途径，其中DNA甲基化发挥了重要作用。因此，寻找与CRC癌变及进展相关的DNA甲基化，并确定与之密切相关的DNA甲基化，对于CRC的诊断治疗以及前期预防意义重大[12]。

CA19-9是细胞膜上的唾液酸的神经节苷脂蛋白，也属糖类抗原；CEA是胎儿和结肠组织中的一种相对分子质量为210K的肿瘤胚胎性抗原，基因编码于19号染色体上的糖蛋白；CA19-9与CEA在正常健康人仅存留微量或者不表达，当细胞癌变时，CA19-9与CEA可重新合成，并表达于肿瘤细胞表面[13]；CA19-9与CEA主要分布在从内胚层分化而来的上皮源性恶性肿瘤细胞表面，在CRC、胆管癌、胰腺癌和肺癌等组织中均表达，均是CRC辅助诊断的比较重要指标之一。消化道恶性肿瘤患者中肿瘤组织CA19-9与CEA均高于健康正常人和癌旁正常组织[14]，这与本文研究结果一致。

SDC家族是硫酸肝素蛋白聚糖成员的I型跨膜蛋白，具有调节生命活动中行使信号转导调节因子的作用，能与细胞外基质相关联的多种蛋白结合，调节、介导细胞和基质的黏附功能，SDC2是转化生长因子β通路的相关基因，该通路与细胞增殖、分化、迁移、血管生成和免疫监控等生理过程的调控有关[15]。SDC2在肿瘤细胞迁移与肿瘤的血管生成均发挥重要密切关系[16]；国内外研究者表明，多种DNA甲基化是消化道肿瘤发生的早期事件，因此特异DNA甲基化可作为消化道肿瘤早期筛查的分子标记。本研究结果发现，CRC组织中SDC2甲基化基因的表达上调，高于癌旁正常组织，并且与对照组相比有明显差异，SDC2甲基化基因是指在DNA甲基转移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移至胞嘧啶第5位碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶，SDC2甲基化基因在CRC中有一个独特的子型为CpG岛甲基化表型，该区甲基化在CRC中表达频率较高，参与了多种肿瘤的恶性生物学行为[17]。本研究发现，CA19-9、CEA与SDC2甲基化基因浓度跟CRC的TNM分期有关，提示分期级别越高CA19-9、CEA与SDC2甲基化基因浓度越高，在分期中的Ⅲ期和Ⅳ期组织中表达均较高，这对CRC的TNM分期的诊断均具有重要的应用价值。SDC2基因的甲基化直接导致该基因功能的变化，SDC2基因的转录及翻译过程均发生改变，导致SDC2的蛋白表达的异常，使SDC2蛋白在结直肠组织中不能正常发挥作用，进而导致CRC的发生，TNM分期可反映CRC的病情严重程度，根据该结果，我们推断CRC的癌变及进展可能与SDC2基因甲基化有关，SDC2甲基化基因可能参与CRC的发生及发展过程，与患者疾病严重程度有关。但本研究中，CA19-9与CEA独立检测或联合检测CRC的灵敏度和特异度结果表明CEA和CA19-9均低于SDC2基因的甲基化的检测，SDC2基因的甲基化的检测可以弥补CEA和CA19-9对CRC辅助诊断的不足，为CRC的诊断提供了一个新的方向，探索CRC诊断潜在分子标志物和治疗靶点提供理论依据；另外，随着SDC2甲基化基因的广泛应用，临床上不仅将SDC2甲基化基因作为CRC诊断的指标，更重要的是用于CRC评估疗效，监测复发和推测预后。

综上所述，SDC2甲基化基因在CRC组织中高表达，并且SDC2甲基化基因在诊断CRC的灵敏度和特异性均高于CEA、CA19-9及CEA联合CA-199；SDC2甲基化基因在CRC的发生及发展等过程中均发挥一定作用，跟肿瘤血清标志物的联合检测能互补优势从而提供更多有用的临床信息，对CRC的诊断和监测均具有临床应用价值。