壳聚糖-白蛋白胶束用于构建血液接触材料表面仿生涂层*

2021-02-25王焕然卞齐豪翁亚军陈俊英

功能材料 2021年1期

王倩，李莉，王焕然，卞齐豪，翁亚军，陈俊英

(1. 西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031;2. 西南交通大学材料科学与工程学院，成都 610031)

0 引言

近年来，血液接触装置(如心血管支架、血管移植物、人工心脏瓣膜、体外膜氧合器电路以及体外循环电路等)在临床上取得了巨大进展，挽救了成千上万人的生命[1-3]。生物材料是用于开发和制造血液接触器件的基础，对生物材料进行设计使其功能化能够改善血液接触器件的性能。比如，经皮植入技术对生物材料提出了新的要求，这些被植入人体几个小时，甚至是终身植入的装置，应满足生物功能性、生物可调性及生物相容性的要求[4]。尽管生物材料科学研究取得了巨大进步，但医疗器械的植入仍面临诸多挑战，例如医疗器械的凝血问题，医疗器械植入人体与血液接触，发生非特异性血浆蛋白吸附，激活血小板，基于纤维蛋白原分子两端的血小板结合位点，活化血小板与吸附在材料表面的纤维蛋白原结合，血小板上存在多个纤维蛋白原受体使其在纤维蛋白原作用下与其他血小板发生聚集。此外，被激活的血小板会释放可溶性因子ADP和血栓素，从而刺激循环血小板形成更大的血小板聚集物。临床上通常使用抗血小板药物或抗凝剂来降低血栓形成的风险，这些药物能够实现抗凝，但会增加患者出血的风险，因此研究者们通过表面修饰抑制植入材料表面非特异性血浆蛋白吸附，但是，降低生物材料对血浆纤维蛋白原的吸附仍不能有效抑制血小板粘附[5]。很长一段时间内，永久性血液接触装置在很大程度上是不可能实现的，寻找血液兼容的生物材料一直是一个难题[6]。

逐层自组装是一种利用相反电荷间静电相互作用制备多层纳米材料的方法[7]，通过装载功能因子，如壳聚糖、透明质酸、肝素、生长因子、抗体及DNA等赋予生物材料抗凝、抗粘附、抗菌、促细胞粘附及基因治疗等功能[8-11]。但是，通过传统逐层自组装技术制备的纳米材料稳定性差，且负载的生物因子不能长期有效地发挥其生物功能。纳米材料的出现为血液接触材料创造了新的机会，研究者已经开发出各种聚合物，包括纳米颗粒、球状胶束、棒状胶束、蠕虫状胶束、纳米管以及多聚体等[12]。聚合物胶束作为嵌段共聚物的自组装体，是一种很有前途的药物和基因传递载体。聚合物胶束具有球形核壳结构，由两亲性嵌段共聚物在水溶液中自组装形成，疏水核为疏水治疗剂的包裹创造了装载空间，通过隔离进入疏水核增加疏水药物的溶解度，而亲水壳稳定胶束，抑制聚集，减少水解、酶解以及肾清除从而延长其在血液中的循环时间[13]。Fatemeh等[14]通过两步法提高镍钛合金的血液相容性和耐腐蚀性，将壳聚糖-肝素纳米颗粒涂覆于阳极氧化后的镍钛合金表面。研究表明，壳聚糖-肝素纳米颗粒涂层抑制镍离子的释放，同时，纳米颗粒涂层控制肝素的释放从而显著改善血液相容性。胶束由于其在各领域的巨大贡献引起了人们的关注，特别是在其用于药物递送领域。胶束不仅可以保护生物活性成分不受到外界环境的干扰，同时还提高药物的稳定性，将药物靶向递送到病灶部位，实现药物的可控释放，减少药物的毒副作用。越来越多的天然和合成材料用于胶束的制备，壳聚糖是一种天然聚合物，具有生物活性、生物可降解性和生物相容性，其在水溶液中带正电荷，具有很强的静电相互作用，能够与三聚磷酸钠在水溶液中自组装形成CS-TPP胶束[15]。CS-TPP对人肝癌细胞系BEL7402的体内外抗肿瘤作用优于壳聚糖分子[16]。Jayakumar等人[17]也对CS-TPP对紫杉醇的负载作用进行了评估，发现它们有效降低了紫杉醇的毒副作用同时保持了其抗肿瘤活性。牛血清白蛋白作为一种无毒、无免疫原性、低成本、生物相容性良好和可生物降解的内源性物质而受到广泛关注，其具有形成凝胶和乳液的独特功能特性，是生物活性化合物的首选包封剂[18]。壳聚糖和牛血清白蛋白都是理想的给药系统，通过控制制备的条件，如pH、离子强度、温度以及蛋白质和多糖的浓度等可以调控蛋白质和多糖之间的相互作用，以此得到不同粒径的胶束[19]。已有研究证实由壳聚糖和白蛋白等天然聚合物自组装形成的胶束可用于生物活性化合物的包封和释放[20]。目前壳聚糖和白蛋白自组装制备胶束多是用于抗癌药物的递送，尚未出现这种胶束对材料进行改性的报道。

本研究通过改变反应物浓度、pH等反应条件，将壳聚糖、三聚磷酸钠和牛血清白蛋白进行了大量的自组装实验，最终获得了CS-TPP-BSA胶束，通过材料学表征测定胶束的尺寸、电位、形态与结构等，通过多巴胺将胶束结合到材料表面，探究胶束改性前后材料对血小板黏附、溶血及血栓形成的影响，为CS-TPP-BSA胶束在改善生物材料的血液相容性方面提供了新的思路。

1 实验

1.1 材料与设备

壳聚糖(CS，aladdin)，三聚磷酸钠(TPP，aladdin)，牛血清白蛋白(BSA，aladdin)，冰醋酸，0.1 mol/L HCL(自配)，0.1 mol/L NaOH(自配)，0.9%NaCl生理盐水(科伦)，去离子水(aladdin)等。pH计、磁力搅拌器、马尔文激光粒度仪、Quanta 200型场发射扫描电子显微镜、JEM-2100F场发射透射电镜、接触角测试仪 DSA100 (Krüss，Hamburg，Germany)、傅里叶变换红外光谱、酶标仪、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、冷冻干燥机等。

1.2 实验方法

1.2.1 CS-TPP-BSA纳米胶束的制备

将壳聚糖加入0.5%(质量分数)的冰醋酸溶液中搅拌3 h，配制成1 mg/mL的壳聚糖溶液，使用0.1 NaOH调节溶液pH为5.00，将TPP加入UP水中溶解，配制成1 mg/mL的TPP溶液，使用0.1HCL调节溶液pH为5.00，按照1∶4的体积比将TPP溶液滴加入壳聚糖溶液中，搅拌1 h形成CS-TPP胶束。将壳聚糖-三聚磷酸钠(CS-TPP)胶束与牛血清白蛋白以1∶4的浓度比混合，在90℃条件下反应1 h，待溶液冷却后使用0.1 mol/L NaOH调节pH至5.95，再使用磁力搅拌0.5 h，壳聚糖-三聚磷酸钠胶束能够在特定pH值下与高温变性的牛血清白蛋白交联形成粒径均匀的壳聚糖-三聚磷酸钠-牛血清白蛋白(CS-TPP-BSA)胶束。

图1 (a) 壳聚糖的化学结构式;(b)壳聚糖-三聚磷酸钠胶束(CS-TPP)的自组装原理Fig 1 Chemical structural formula for chitosan and self-assembly principle of chitosan-sodium tripolyphosphate micelles (CS-TPP)

图2 壳聚糖-三聚磷酸钠-牛血清白蛋白胶束(CS-TPP-BSA)的制备原理图Fig 2 Schematic diagram of preparation of chitosan-sodium tripolyphosphate-bovine serum albumin micelle (CS-TPP-BSA)

1.2.2 功能化胶束引入材料表面

将玻璃片用玻璃刀切成1 cm×1 cm大小作为基底材料，用乙醇和RO水分别超声清洗3遍，每次5 min，吹干备用。将切好且清洗好的玻璃片置于大的玻璃培养皿中，加入多巴胺-盐酸盐(2 mg/mL)的Tris缓冲液(pH=8.50)使之没过基底材料表面，于37 ℃下反应过夜，将反应后的多巴胺溶液倒出，用RO水超声清洗，每次5 min以除去材料表面弱结合的多巴胺，将沉积了多巴胺涂层的玻璃片浸没在CS-TPP和CS-TPP-BSA溶液中12h，用RO水清洗干净后烘干待用。

图3 功能化胶束在聚多巴胺表面固定示意图Fig 3 The functionalized micelles grafted on the surface of polydopamine

1.2.3 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的水合粒径及Zeta电位

取等量制备好的CS-TPP和CS-TPP-BSA溶液，在马尔文激光粒度仪中对两组样品的水合粒径和Zeta电位进行检测。

1.2.4 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的扫描电镜图(SEM)

将接枝到多巴胺涂层玻璃片表面的CS-TPP和CS-TPP-BSA纳米颗粒放置于-4 ℃环境中冷冻2 h，当材料表层液体结冰之后迅速将其从冰箱中取出，放置于冷冻干燥机中真空干燥，冷冻干燥后使用导电胶粘贴到扫描电镜专用托盘上喷金处理，置于扫描电镜真空腔内扫描其表面形态。

1.2.5 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的透射电镜图(TEM)

将制备好的浓度为0.1mg/mL的CS-TPP和CS-TPP-BSA胶束滴加到铜网表面，室温条件下自然晾干，置于透射电镜的真空腔内观察其结构。

1.2.6 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的激光扫描共聚焦(LSCM)

采用激光扫描共聚焦显微镜表征壳聚糖在CS-TPP-BSA胶束中的分布位置，使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的壳聚糖进行样品的制备，将最终产物CS-TPP和CS-TPP-BSA分别进行LSCM表征。

1.2.7 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的傅里叶变换红外光谱(FTIR)

取少量CS-TPP和CS-TPP-BSA胶束溶液进行冷冻干燥，干燥完毕后将二者的粉末分别与溴化钾在干燥环境下研磨，压制成片，之后用傅里叶变换红外光谱仪进行检测。

1.2.8 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的X射线能谱(EDS)分析

将制备好的浓度为0.1mg/mL的CS-TPP和CS-TPP-BSA胶束溶液滴加到铜网表面，室温条件下自然晾干，置于透射电镜的真空腔内利用其EDS附件对纳米胶束进行面分析来确定其成分。

1.2.9 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的水接触角

将空白玻璃片、接枝CS-TPP涂层玻璃片和接枝CS-TPP-BSA涂层的玻璃片进行水接触角测量。

1.2.10 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束对血小板粘附的影响

将接枝到多巴胺涂层玻璃片表面的CS-TPP和CS-TPP-BSA样品置于24孔板中。取抗凝兔血于1350rpm离心15 min，取上清液即为富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)，每孔加入500 μL富板浆浸没样品表面，于37 ℃孵育45 min后PBS清洗3次，用2.5%戊二醛固定过夜，将固定好的样品用PBS清洗3次，用罗丹明溶液避光染色15 min再用PBS避光清洗3次，依次浸泡在50%、75%、90%、100%的无水乙醇中脱水，每次15 min，用荧光显微镜观察其数量。

1.2.11 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的溶血实验

用生理盐水将新鲜人全血稀释至2%的浓度，阳性对照组使用RO水进行稀释，阴性对照组使用生理盐水进行稀释；将制备好的样品置于24孔板中，每孔加入500 μL稀释后的人全血，置于37 ℃恒温水浴锅中孵育1 h，分别吸取孵育后的样品浸没液加入TCP管中，以1 000 r/min的速度离心10 min，吸取上清液置于96孔板中，用酶标仪在540 nm波长下测定吸光度值，并且计算其溶血率。

溶血率=[(A-B)]/[(C-B)]×100%

(1)

式中：A为实验组的吸光度值；B为阴性对照组的吸光度值；C为阳性对照组的吸光度值。

判断标准：当溶血率低于5%时，说明材料符合植入材料的标准要求；当溶血率高于5%，说明材料有溶血性，不符合植入材料的标准要求。

1.2.12 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束对血栓吸附的影响

将制备好的样品置于24孔板中，每孔加入400 μL抗凝兔血，于37℃孵育45min后，用PBS清洗样品，用2.5%戊二醛固定，观察材料的抗血栓吸附性能。

2 结果与讨论

2.1 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的水合粒径及Zeta电位

由图4A的粒径图可以得知CS-TPP的粒径为334.1 nm，CS-TPP-BSA的粒径为410.1 nm，在牛血清白蛋白结合前后粒径发生了变化，可能是因为牛血清白蛋白的引入增大了胶束的粒径。对CS-TPP-BSA的稳定性进行了检测，通过测试1 h到42 h的粒径变化可以看出胶束发生一定程度的聚集，在6h之后胶束的粒径不再发生较大的改变，说明胶束具有较好的稳定性。通过Zeta电位分析可以看出CS-TPP的Zeta电位为9.74 mV，CS-TPP-BSA的Zeta电位为12.8 mV，在牛血清白蛋白接枝后纳米胶束的电荷数升高。Zeta电位的绝对值越高体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集，反之，Zeta电位的绝对值越低，此时吸引力大于排斥力，体系分散被破坏因此易于发生凝结或凝聚，因此可以说明牛血清白蛋白的引入增强了胶束的稳定性。

2.2 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的扫描电镜图

由图4B中的扫描电镜图(b1)、(b2)可以看出CS-TPP的粒径为三百多纳米，由(b3)、(b4)可以看出CS-TPP-BSA的粒径大概为400nm左右，符合DLS的测试结果。在CS-TPP的扫描电镜(b1)、(b2)中，因为制备的CS-TPP溶液没有接枝在多巴胺表面直接涂覆于材料表面，溶液中除了CS-TPP胶束外还存在大量未形成胶束的壳聚糖溶液，所以扫描电镜下观察到的胶束被壳聚糖溶液覆盖导致SEM图像没有颗粒分明。图4B(b3)、(b4)中CS-TPP-BSA通过多巴胺接枝在材料表面，可以观察到CS-TPP-BSA为大小均一的圆球形颗粒，形态稳定，且均匀分散于材料表面。

2.3 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的透射电镜图

在图4C(c1)、(c2)的TEM图像中可以观察到CS-TPP胶束在溶液中不稳定，容易形成一些相互连接的团聚体，一些没有发生团聚的CS-TPP可以看出CS-TPP胶束的结构为三百多纳米的球形结构。在图4C(c3)、(c4)的TEM图像中可以观察到CS-TPP-BSA胶束在溶液中可以稳定存在，且大小、形态均一，不易发生团聚，分散性较好。通过对单个CS-TPP-BSA胶束进行观察，可以发现在胶束表面有一层颜色较浅的包覆层，与CS-TPP胶束相比，其粒径增大，说明白蛋白在CS-TPP表面成功包覆后，粒径增大。

图4 A. CS-TPP和CS-TPP-BSA的水合粒径及Zeta电位；B. CS-TPP和CS-TPP-BSA的扫描电镜图;C. CS-TPP和CS-TPP-BSA的透射电镜图Fig 4 The particle size and Zeta potential of CS-TPP and CS-TPP-BSA, and scanning electron microscopy and transmission electron microscopy of CS-TPP and CS-TP-BSA

2.4 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的激光扫描共聚焦(LSCM)荧光图

由图5(A)可以看到CS-TPP和CS-TPP-BSA的激光扫描共聚焦荧光图，因为CS-TPP未接枝在多巴胺涂层表面，且CS-TPP本身不稳定容易发生团聚，从而出现大片黏连的情况，因此经过FITC标记的壳聚糖显示出大片荧光，而CS-TPP-BSA的荧光明显减少，可能是由于白蛋白包覆在CS-TPP表面导致经FITC标记的壳聚糖被白蛋白包裹无法显示荧光，间接证明了白蛋白接枝在CS-TPP胶束表面。

2.5 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的X射线能谱(EDS)分析

从图5(B)中CS-TPP和CS-TPP-BSA的EDS面扫描结果中可以很直观的观察到胶束表面的元素变化，因为壳聚糖和三聚磷酸钠中均无硫元素存在，因此在CS-TPP的EDS元素分布图中没有S元素分布，C、N、O元素的荧光分布较弱，推测可能是由于壳聚糖在三聚磷酸钠的交联作用下形成胶束导致基团被自组装在胶束内部，因此表面元素荧光分布较少。引入BSA后，由于BSA中二硫键和巯基中硫元素的存在，因此在CS-TPP-BSA胶束表面检测出S元素分布，同时观察到C、N、O元素荧光分布增强，说明BSA的引入增强了其荧光强度，进一步证明BSA包覆于CS-TPP胶束的表面。

图5 (a) CS-TPP和CS-TPP-BSA的激光扫描共聚焦(LSCM)荧光图;(b) CS-TPP和CS-TPP-BSA的EDS面扫描结果图Fig 5 Laser scanning confocal (LSCM) fluorescence and EDS mapping results of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.6 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy，FTIR)

利用红外光谱对牛血清白蛋白、壳聚糖、三聚磷酸钠和CS-TPP-BSA胶束进行了表征，对光谱基线进行校正和归一化后得到图6结果。通过对比光谱发现，在CS-TPP-BSA的红外光谱中可以观察到壳聚糖的特征吸收峰。在壳聚糖的红外光谱中3 750 cm-1到3 300 cm-1范围内宽而强的峰可归因于O-H的伸缩振动， N-H 的分子间氢键的吸收峰在3 446 cm-1， C=O振动对应的酰胺Ⅰ带吸收峰在1 650 cm-1处，在1 594 cm-1处观察到从酰胺I和II延伸的N-H。在N-H变形和C-N伸缩振动的共同作用下，会在1 332 cm-1和1 089 cm-1处观察到酰胺Ⅲ带和C=O产生的条带。在TPP的红外光谱中，主要观察到P=O、PO2、PO3分别在1 220、1 148和1 080 cm-1处拉伸，以及在900 cm-1处PO键随POP的反对称拉伸。在CS-TPP-BSA中，P=O、PO2和PO3分别在1 220、1 148和1 080 cm-1处存在，证明了壳聚糖掺入TPP，大约3 400 cm-1处O-H伸缩振动产生的峰值趋于扩大，这是由于氢键间约束力增加，酰胺Ⅱ带N-H峰值由1 594 cm-1位移至1 567 cm-1。在1 420 cm-1处，由于羰基的极化增强导致CH2的角变形峰明显增强。在750 cm-1以下还观察到由于络合构象的限制使得TPP的骨架振动模式减少或消失，从而说明氨基与三聚磷酸钠分子之间发生了相互作用。有研究表明，当壳聚糖和牛血清白蛋白之间发生静电相互作用或者形成氢键时会使其在1 650 cm-1和1 332 cm-1处的C=O和N-H组的峰值与纯壳聚糖相比有所减少。通过对制备的CS-TPP-BSA胶束进行红外光谱普进行对比分析，发现由于壳聚糖多糖阳离子与牛血清白蛋白聚阴离子间的静电相互作用导致壳聚糖的O-H、C=O和NH2在CS-TPP-BSA上的特征吸收由高波数向低波数发生偏移，进一步证明了CS-TPP-BSA的成功制备。

图6 CS-TPP和CS-TPP-BSA的FTIR结果图Fig 6 FTIR result of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.7 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束的水接触角(Water Contact Angle, WCA)

图7是不同样品的水接触角结果，经过观察可以看出玻璃片表面的水接触角为63.3°±1.00°，在玻璃片表面沉积多巴胺之后水接触角变为61.4°±0.23°，可能是因为沉积多巴胺增大了玻璃片表面的粗糙度，同时由于亲水性基团氨基的引入导致材料的亲水性增高，从而水接触角减小。在多巴胺涂层表面接枝CS-TPP后水接触角变为56.5°±0.90°，因为壳聚糖中氨基的引入使材料表面的亲水性进一步提高。在多巴胺涂层表面接枝CS-TPP-BSA后水接触角变为55.6±1.05°，可能是因为白蛋白的引入增加了亲水性基团氨基和羧基的含量，但是白蛋白通过羧基与壳聚糖的氨基通过静电相互作用消耗了一部分的亲水性基团，因此材料的亲水性几乎没有发生改变。

图7 CS-TPP和CS-TPP-BSA的WCA结果图Fig 7 WCA result of CS-TPP and CS-TPP-BSA

2.8 牛血清白蛋白结合前后的壳聚糖-三聚磷酸钠胶束对血液相容性的影响

图8(a)为血小板在各种样品表面的静态粘附荧光结果图，通过荧光染色的结果可以看出沉积了多巴胺涂层的材料表面粘附的血小板数量明显多余光滑的玻璃片表面粘附的血小板数量，主要原因是多巴胺涂层表面存在大量有利于血小板粘附和激活的反应性基团，如酚羟基和醌基等。在接枝了CS-TPP之后，由于壳聚糖良好的凝血性能促进了血小板在CS-TPP涂层表面的粘附，而接枝了CS-TPP-BSA的涂层表面血小板的粘附量显著降低。图8(b)显示的是样品材料对于血栓的吸附情况，由数码拍照图可以很直观的观察到空白玻璃片表面对于血栓具有较强的吸附性，在接枝了CS-TPP涂层之后，材料对于血栓的吸附性显著降低，而接枝CS-TPP-BSA的材料表面具有更加优越的抗血栓吸附性能。图8(c)为溶血实验结果的数码拍照图，通过观察发现除了阳性对照组发生了溶血现象，其他组均未出现明显的溶血现象。根据图8(d)的溶血率统计图可以看出阴性对照组的溶血率为0，阳性对照组的溶血率为100，CS-TPP和CS-TPP-BSA的溶血率均低于5%，且CS-TPP-BSA的溶血率低于CS-TPP的溶血率，说明材料均不具有溶血性。综上所述， CS-TPP-BSA胶束能显著改善生物材料表面的抗血小板及血栓吸附性能，具有良好的血液相容性，符合生物材料的植入标准要求。

图8 (a) CS-TPP和CS-TPP-BSA对血小板的粘附荧光图;(b) CS-TPP和CS-TPP-BSA的溶血实验结果;(c) CS-TPP和CS-TPP-BSA的血栓吸附实验结果Fig 8 Fluorescence of platelet adhesion between CS-TPP and CS-TP-BSA and hemolysis test and thrombus adsorption experiments results of CS-TPP and CS-TPP-BSA