IRF6调控IFN-β的功能验证与结构研究

魏迪洋, 闫利明, 李巍然, 贾绮林

(1.北京大学口腔医学院 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081; 2.清华大学 结构生物学实验室 教育部蛋白质科学重点实验室，北京 100084)

干扰素-β属于I型干扰素，是由人成纤维细胞产生的细胞因子，具有参与免疫调节、抑制病毒复制、抗寄生虫、抗肿瘤等重要作用[1]。Kowalec等通过全基因组关联分析，揭示出使用干扰素-β疗法治疗多发性硬化时药物介导的肝脏损伤(Drug-induced liver injury，DILI)的发生与干扰素调节因子6(Interferon regulatory factor 6, IRF6)基因的差异表达有关，从遗传学的角度提示了IRF6基因及表达产物调控着干扰素-β介导的细胞免疫应答反应[2]。IRF6是干扰素调节因子家族(IRFs)的重要成员，位于染色体1q32.2区域，表达产物为转录因子。该家族成员具有相似的N端结构域，可结合干扰素-β启动子片段中的干扰素-β激活反应元件(IFN-β-stimulated response element，ISRE)[1]。

近年来的研究显示，IRF6的差异表达在多种临床疾病中扮演着重要角色。IRF6调控着炎症状态下口腔黏膜角化上皮的炎症细胞因子(包括IL-36γ[3]等)的分泌过程，并且其表达异常将削弱口腔黏膜对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)及其他可疑致病菌的免疫屏障作用[4]。这揭示出IRF6基因及表达产物对机体免疫应答反应的调控作用。IRF6在肿瘤的发生与抑制中也起着关键作用。Xu等[5]研究发现IRF6有望成为未分化型鼻咽癌靶向治疗的突破点。Nobeyama等[6]发现，IRF6 5′端CpG双核苷酸岛的甲基化水平与黑色素瘤细胞对干扰素的反应呈负相关。此外，IRF6参与外皮层(periderm)的形成，是口颌面发育，尤其是唇与腭部发育调节网络中的重要成员[7]。非综合征型唇腭裂(NSCL/P)是一类常见的先天畸形，是由遗传因素和环境因素共同参与的复杂疾病。IRF6是迄今为止发现的与NSCL/P最为相关的基因[8-9]，并已证实是范德伍德综合征(Van der Woude syndrome, VWS)和腘翼状胬肉综合征(popliteal pterygium syndromes, PPS)的致病基因[10]。IRF6广泛参与各种信号通路及生理生化过程，在RIPK4、p63[11]、Notch[12-13]、TGFβ[14-15]、TLR[16]等信号通路中均发挥着重要作用，与多种生物体生长发育相关基因如Msx1、PAX9、GRHL3等存在共表达等相互作用[17]，并参与细胞增殖、细胞周期、表皮发育、免疫应答等过程的调控。

目前对IRF6调控干扰素-β相关的免疫通路尚无明确的分子生物学及功能验证，并且IRF6蛋白的三维结构研究仍为空白，而结构生物学是揭示蛋白质生理生化功能的重要手段和基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用的大肠杆菌E.coliBL21，DH5α感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司生产；原核表达载体pET-28a为实验室自备；限制性内切酶NdeI和XhoI 为TaKaRa公司产品；PCR酶为北京擎科新业生物技术有限公司生产的金牌mix；高纯度质粒小提试剂盒和快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品；Ni-NTA亲和层析介质购自金斯瑞生物科技公司；离子交换HiTrap SP column购自美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建

根据NCBI收录IRF6基因的编码区序列，由无锡青兰公司进行IRF6基因的合成与原核表达的密码子优化。根据优化序列由睿博兴科公司合成引物。正向引物：5′-GGAATTCCATATGGCGTTACATCCTCG-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGTTAGCTGCCCGGGTTAAT-3′。

对N端1～386位碱基进行PCR扩增，琼脂糖凝胶(1%)回收目的片段，利用限制性内切酶NdeI和XhoI 对载体和基因片段进行酶切处理(5～6 h)。利用T4连接酶对载体和基因片段进行连接，16 ℃过夜连接。将连接产物转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养箱中倒置培养12～20 h。挑选单菌落接种5 mL的LB(Lysogeny Broth)液体培养基(卡纳霉素抗性)，在37 ℃摇床中培养6～10 h，利用小量质粒提取试剂盒进行质粒提取，并送阳性克隆进行测序，核对分子构建结果。

1.2.2 蛋白的检测表达与纯化

将测序阳性克隆用于转化BL21(DE3)感受态细胞，37 ℃培养箱中培养12～20 h；挑取单菌落，接种到5 mL的LB液体培养基中37 ℃摇床中过夜培养。将5 mL培养物接种到800 mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基，预热的37 ℃摇床培养OD600数值达到0.8(约4 h)。将培养物放入冰水混合物中降温10 min，加入0.3 mL IPTG 诱导剂后转移16 ℃的摇床培养12～17 h。4 500 r/min，离心10 min收集大肠杆菌，使用Lysis Buffer(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，pH 8.0)重悬。重悬液中加入1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF。用超高压细胞破碎仪(聚能生物公司，JNBIO)进行细胞破碎，收集破碎后的菌液在冰水浴中置于超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份公司，SCIENTZ-IID)设置功率200 W，工作10 min。细胞碎片和上清液使用14 000 r/min离心40 min进行分离。将高速离心得到的上清液用于Ni2+-NTA亲和柱纯化。使用20 mmol/L的咪唑溶液充分洗净亲和柱上的残留杂蛋白，500 mmol/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白。

将洗脱后的蛋白样品浓缩、降咪唑浓度后使用离子交换层析柱HiTrap SP column进一步纯化。缓冲液A：20 mmol/L Tris；缓冲液B：20 mmol/L Tris；1 mol/L NaCl，pH值均为8.0。分布收集蛋白样品，并使用SDS-PAGE检测蛋白的纯度。

1.2.3 蛋白核酸复合体组装及晶体筛选

选择IFN-β启动子中长度为13 bp的一段碱基序列，于睿博兴科公司合成其互补的两条DNA单链，设置PCR程序(98 ℃变性10 min，之后从95 ℃起每次下降10 ℃，每个温度维持12 s，最终降至25 ℃后以4 ℃、10 min结束)，可得到DNA双链。两条互补的DNA单链序列：AAAGTGAAAGTGA；TTCACTTTCACTT。

将过量的dsDNA与浓缩至15 mg/mL的IRF6 N端结构域蛋白(以下简称IRF6 N1)混合后置于冰上孵育2 h后4 ℃高速离心10 min，除去沉淀，然后在16 ℃晶体室中使用悬滴气相扩散法筛选晶体。使用Hampton Research公司相关结晶试剂(表1)。

表1 晶体筛选与优化中使用的试剂盒

1.2.4 EMSA试验验证蛋白与核酸相互作用

通过EMSA试验验证IRF6 N1与IFN-β启动子核酸的相互作用。制备体积分数为10%的Native胶，依照表2的成分加入EP管中，冰上孵育40 min后上样，冰水浴电泳(7 mA、120 min)。结束后将胶放置到具有核酸染料的缓冲液中染色5 min，在紫外光下观察条带。

表2 EMSA中不同浓度配比的蛋白与核酸成分

2 结果

2.1 基因克隆和重组表达质粒的鉴定

PCR产物经体积分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见在250～500 bp有特异性条带(图1)，大小与386 bp预期相符。

左侧泳道为IRF6 N1核酸片段的扩增结果，对应N端1～386位碱基，片段大小为386 bp；右侧泳道为DNA Marker

将质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI 进行酶切，37 ℃水浴锅中酶切30 min，1%琼脂糖凝胶鉴定，可见约386 bp的目的基因片段。

将测序结果与载体和基因序列仔细核对，确认已将IRF6基因N端1～386位碱基克隆到了pET-28a载体上。

2.2 重组蛋白的纯化

选择20 mmol/L的咪唑浓度进行洗杂，500 mmol/L的咪唑浓度进行目的蛋白的洗脱。洗脱后的蛋白降咪唑浓度至100 mmol/L以下，以防止影响蛋白性质。

将Ni亲和柱洗脱的目的蛋白进行HiTrap SP column离子交换层析柱纯化，紫外UV280的吸收图谱如图2(a)。根据出峰位置选取峰形对称区域的蛋白，通过SDS-PAGE分析表明纯化后的重组蛋白纯度较高[图2(b)]。

(a)IRF6 N1蛋白通过 HiTrap SP column离子交换层析柱纯化紫外吸收图谱；(b)纯化后的IRF6 N1蛋白SDS-PAGE结果图，左侧泳道为IRF6 N1蛋白，右侧为蛋白Marker

2.3 蛋白-核酸复合体晶体生长

在组装完成的蛋白-核酸复合体溶液中加入4 mmol/L的还原剂DTT后进行晶体生长筛选。最终优化的晶体生长的池液条件为160 μL PEG/Ion 1 14号混合40 μL Index 54号。选择显微镜下形态较佳的晶体进行进一步X射线衍射试验与晶体解析(图3)。

(a)经过优化的晶体照片；(b)晶体的衍射图。分辨率达2.68Å

2.4 蛋白-核酸相互作用的EMSA验证

通过EMSA试验，证明了IRF6 N1与IFN-β启动子核酸确实具有较强的相互作用[图4(a)]，可形成蛋白-核酸复合体，并且随蛋白与核酸物质的量配比变化结合能力随之变化[图4(b)]。不过EMSA无法准确定量指示蛋白与核酸结合的配比，IRF6 N1与IFN-β启动子核酸的具体作用方式仍需复合体结构的解析来进一步揭示。

(a)左侧泳道为空白核酸对照，右侧泳道为加入了蛋白与核酸孵育后的结果，可见在泳道上方形成了明显的蛋白-核酸复合体条带；(b)将蛋白与核酸按照不同的物质的量配比进行孵育后的EMSA结果，从左到右分别为1～7号泳道。相应配比详见表2

3 讨论与结论

干扰素调节因子家族(IRFs)是一类重要的转录因子，在机体病毒感染后的干扰素调节通路及干扰素诱导基因的调控中起着十分重要的作用。该家族中已有IRF1[18]、IRF3[19-20]和IRF7[19]等解析出了与干扰素-β启动子或增强子核酸形成的蛋白-核酸复合体三维结构，直接揭示了其对干扰素-β相关免疫调节通路的调控作用与作用方式。保守结构域预测显示蛋白IRF6 N端是一段IRF超家族结构域，即具有3个DNA结合位点(DNA-binding region)。该结合位点由5个进化保守的色氨酸重复序列构成，因此也称为“trytophan pentad repeat”[1]。据文献报道该家族特征性的DNA结合位点可以与干扰素β启动子元件中特定的片段结合，是一种α螺旋-转角-α螺旋模体结构(helix-turn-helix motif)。从保守结构域的预测结果推测IRF6具有同家族其他成员类似的干扰素-β免疫调节通路的调控作用。研究显示，IRF1可以与干扰素β启动子中的positive regulatory domain I(PRD I)识别并形成复合体[18]，IRF3、IRF7可与PRD I和PRD III识别并与ATF-2/c-Jun共同形成蛋白-核酸复合体[19-20]。本研究通过EMSA试验定性验证了IRF6 N端结构域与干扰素β启动子元件的PRD I片段具有明确相互作用。该推测的证实将对IRF6在相关疾病的治疗中干扰素药物的应用提供思路和依据。

通过将蛋白溶液与双链DNA核酸片段孵育后结晶，多轮优化后获得了形态较佳的蛋白晶体，在初步的X射线衍射试验中获得了较好的衍射图像，并获得了2.68Å的高分辨率数据。这将为获得干扰素调节因子6蛋白N端结构域三维结构的解析提供帮助。初步的结构解析结果显示获得的晶体为蛋白质与核酸的复合物。蛋白-核酸复合体三维结构的揭示可以提供蛋白质的结构信息，为相关病理机制的解释和免疫、基因疗法的探索提供了重要研究基础。

致谢：感谢合作单位清华大学结构生物学实验室提供的专业指导与帮助。