miR-204过表达对喉鳞癌细胞增殖、周期、凋亡及侵袭的影响及机制

罗德艳，冯俊，彭涛，唐一萍，杨久梅

川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院，四川南充637000

喉癌属头颈部恶性肿瘤，其主要病理学类型为喉鳞状细胞癌（鳞癌），该病早期诊断率低、长期生存率不高，且癌细胞增殖、侵袭是造成治疗失败的重要原因［1］。因此，探索喉鳞癌特异性分子标志物和有效的基因治疗靶点，对喉鳞癌早期诊治、有效治疗尤为重要。近年来研究表明，微小RNA（miRNA）在恶性肿瘤早期诊断、靶向治疗、预后评估等方面有良好应用前景［2］。miR-204 是 miRNA 成员之一，已有研究发现其在肝癌［3］、前列腺癌［4］、胃癌［5］、宫颈癌［6］等多种恶性肿瘤中呈低表达，上调miR-204 表达可抑制细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡。但目前国内外缺乏关于miR-204 与喉鳞癌的研究，并且有待进一步明确其作用机制。因此，2020 年4—7 月，本研究通过观察miR-204 过表达对喉鳞癌细胞生物学行为的影响，以期为喉鳞癌的靶向治疗提供新思路。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人喉鳞癌细胞株Hep-2 由华西医学实验中心惠赠；RPMI1640 培养基、胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；LipofectamineTM2000、TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；miR-204 mimics及NC-mimics购自上海吉玛制药技术有限公司；miR-204 及U6 引物购自苏州金唯智生物科技有限公司；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术股份有限公司；CCK8 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；一抗高迁移率组蛋白A2（HMGA2）和 GAPDH 抗体均购自美国 Santa Cruz 公司；HRP 标记的二抗购自美国Bioworld 公司；Tran⁃swell 小室购自美国 Corning 公司；基质胶、FACSCali⁃bur 流式细胞仪购自美国BD 公司；Light Cycler 480 PCR仪购自瑞士ROCHE公司；Synergy 4多功能酶标仪购自美国Bio Tek公司。

1.2 细胞培养及转染 将Hep-2 细胞培养在RP⁃MI1640 培养基（含胎牛血清10%、链霉素、青霉素）中，培养条件：37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱。取生长状态良好的对数生长期细胞随机分为miR-204 模拟物组、阴性对照组、空白对照组，根据Lipofectami⁃neTM2000转染试剂说明进行操作，miR-204模拟物组和阴性对照组分别转染miR-204 mimics（使miR-204过表达）和 NC-mimics（miR-204 mimics 的阴性对照），空白对照组不进行转染。。

1.3 Hep-2 细胞中miR-204 表达检测 采用qRTPCR法。转染后24 h，根据TRIzol法提取Hep-2细胞总RNA，紫外分光光度仪测定含量、纯度，将总RNA反转录为cDNA。以cDNA 为模板，加入引物，进行qRT-PCR 检测。miR-204 上游引物序列5'-TG⁃GTTTTTTTTTAAATTAAGTTAGTAAAGT-3'，下 游引物序列5'-ACAACCTACACAAAACAACCTATA⁃ATC-3'。内参U6 上游引物序列5'-CTCGCTTCG⁃GCAGCACA-3'，下 游 引 物序列 5'-AACGCTTCAC⁃GAATTTGCGT-3'。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性 20 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，40 个循环。以 U6 为内参，采用 2-∆∆Ct法计算 miR-204 的相对表达量。

1.4 Hep-2 细胞增殖能力检测 CCK8 实验。转染后24 h，取各组细胞，以100 μL/孔（约1×104个细胞）将细胞接种于96孔板中，各组设立6个平行孔，培养24、48、72 h 后，各孔加入 CCK8 试剂10 μL，继续于37 ℃培养4 h。用酶标仪测定各孔450 nm 波长处的吸光度（OD）值，以OD值代表细胞增殖能力。

1.5 Hep-2 细胞克隆能力检测 采用平板克隆形成实验。取转染24 h 后的各组细胞，胰酶消化，PBS洗涤，加入RPMI1640 培养基中，制备细胞悬液；稀释后每组以600个细胞/孔的密度，接种到6孔板；培养14 d，用PBS 洗涤，多聚甲醛4%固定15 min，清除固定液，细胞染色20 min，去染色液，室温干燥；显微镜下观察克隆，超于50 个细胞的集落表示为1 个克隆，计数克隆数。

1.6 Hep-2 细胞周期测定 采用流式细胞术。转染后24 h，取各组细胞，用PBS 洗涤，加70%预冷乙醇4 ℃固定；隔夜后离心，分离乙醇，去上清，PBS 洗涤，加碘化丙啶50 μg/mL、RNase 50 μg/mL，4 ℃避光染色30 min。用流式细胞仪统计各周期细胞，计算G0/G1期、S期、G2/M期细胞占总细胞的比例。

1.7 Hep-2细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。转染后24 h，各组取1×105个细胞，离心5 min（1 000 r/min，离心半径10 cm），去上清液，加入结合液500 μL 重悬细胞；后加入 Annexin V-FITC 5 μL 混匀，加入Propidium Iodide 5 μL 混匀，室温孵育15 min。用流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.8 Hep-2 细胞侵袭能力检测 采用Transwell 实验。转染后24 h，取各组细胞，采用无血清培养基制备细胞悬液，取含 2×105个细胞（200 μL 单细胞悬液）加于预铺基质胶的Transwell 小室上室，将含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基500 μL 加入下室，孵育24 h，取出小室，轻微擦拭上室细胞，除去未穿膜的细胞，用4%多聚甲醛固定，染色、风干，显微镜（×100）观察，随机取5个高倍视野，计数穿膜细胞数。

1.9 Hep-2 细胞内HMGA2 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。转染后24 h，取各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。取50 μg 总蛋白，应用10% SDS-PAGE 分离蛋白，将产物转到PVDF 膜上，用含有5%脱脂牛奶的封闭液在4 ℃条件下浸泡膜4 h，加入一抗HMGA2（1∶1 000 稀释）和GAPDH（1∶2 000 稀释），4 ℃条件下孵育过夜，TBS缓冲液洗膜后加入二抗IgG，在室温条件下继续反应2 h，ECL 显影液显影。HMGA2蛋白相对表达量=HMGA2条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.10 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用±s表示，三组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组转染后miR-204 表达比较 空白对照组、阴性对照组、miR-204模拟物组miR-204相对表达量分别为 0.97 ± 0.10、1.01 ± 0.09、10.54 ± 0.49。miR-204 模拟物组miR-204 相对表达量高于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），而空白对照组与阴性对照组miR-204 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 miR-204 过表达对Hep-2 细胞增殖能力的影响 培养24、48、72 h，miR-204 模拟物组OD 值均低于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），空白对照组与阴性对照组各时间点OD 值比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表1。

表1 三组培养不同时间细胞增殖能力比较（±s）

表1 三组培养不同时间细胞增殖能力比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05。

组别空白对照组阴性对照组miR-204模拟物组OD值培养24 h 0.682±0.081 0.692±0.077 0.456±0.062*#培养48 h 1.158±0.142 1.189±0.123 0.747±0.108*#培养72 h 1.841±0.158 1.955±0.196 1.075±0.140*#

2.3 miR-204过表达对Hep-2细胞克隆形成能力的影响 空白对照组、阴性对照组、miR-204 模拟物组、阴性对照组、空白对照组细胞克隆数分别为（120 ± 23）、（117 ± 18）、（55 ± 10）个。miR-204 模拟物组细胞克隆数低于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），空白对照组与阴性对照组细胞克隆数比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 miR-204 过表达对Hep-2 细胞周期的影响miR-204 模拟物组G0/G1期细胞比例高于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），S 期、G2/M 期细胞比例低于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05）；空白对照组与阴性对照组细胞周期分布比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表2。

表2 各组细胞周期分布比较（%，±s）

表2 各组细胞周期分布比较（%，±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05。

组别空白对照组阴性对照组miR-204模拟物组Hep-2细胞G0/G1期44.95±7.26 46.62±7.59 68.19±9.45*#S期30.02±5.38 29.14±5.12 17.76±3.35*#G2/M期25.03±5.27 24.24±5.08 14.05±2.73*#

2.5 miR-204过表达对Hep-2细胞凋亡的影响 空白对照组、阴性对照组、miR-204 模拟物组细胞凋亡率分别为（4.87±1.89）%、（5.01±2.01）%、（21.64±4.89）%。miR-204 模拟物组细胞凋亡率高于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），而空白对照组与阴性对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6 miR-204 过表达对Hep-2 细胞侵袭能力的影响 空白对照组、阴性对照组、miR-204 模拟物组穿膜细胞数分别为（200± 28）、（195± 25）、（103± 17）个。miR-204 模拟物组穿膜细胞数低于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），而空白对照组与阴性对照组穿膜细胞数比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.7 miR-204 过表达对 Hep-2 细胞 HMGA2 蛋白表达的影响 空白对照组、阴性对照组、miR-204 模拟物组HMGA2 蛋白相对表达量分别为0.99 ± 0.09、1.02± 0.11、0.39± 0.14。miR-204 模拟物组Hep-2细胞HMGA2 蛋白相对表达量低于空白对照组、阴性对照组（P均<0.05），而空白对照组、阴性对照组HMGA2 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

miRNA 是特异性结合靶基因mRNA 的非编码小分子RNA，长20～25 个核苷酸，可引起靶基因mRNA 降解或抑制其翻译，从而达到调控下游基因的作用。目前认为，miRNA 广泛参与机体的生物学行为，与恶性肿瘤发生、进展、预后关系密切。许多异常表达的miRNA 在喉癌发生发展中起着癌基因或抑癌基因作用，可能为喉癌的靶向治疗提供新的方向。

miR-204 是miRNA 家族重要的成员，其编码基因位于人9 号染色体，研究发现其可能成为新的抑癌基因。研究发现，miR-204 过表达可促使色素上皮衍生因子失控，诱发前列腺癌［7-8］。而在头颈部鳞癌细胞中miR-204 过表达能够抑制肿瘤靶基因水平，并抑制细胞迁移、侵袭，发挥抑癌作用［9］。目前miR-204 在非小细胞肺癌［10］、卵巢癌［11］等肿瘤中的研究均发现，miR-204 过表达具有明确的抑癌作用。研究表明，miR-204 表达与p-STAT3 和抗凋亡基因Bcl-2 呈负相关，miR-204 过表达可抑制癌症细胞活力，诱导细胞凋亡［12］。但目前关于miR-204 对喉鳞癌的作用机制还有待进一步明确。本研究结果显示，miR-204过表达能抑制喉鳞癌Hep-2细胞增殖活性，同时降低细胞克隆形成能力；miR-204 过表达能够将喉鳞癌Hep-2 细胞周期阻滞于G0/G1期，并促进癌细胞凋亡；并且miR-204 过表达能够抑制喉鳞癌Hep-2 细胞的侵袭。以上提示miR-204 可能作为一种抑癌基因参与喉鳞癌的发生、发展过程。

HMGA2是高迁移率族蛋白超家族成员之一，其定位于人染色体12q13-15。HMGA2 在人正常组织中不表达或者表达极低，但是其在胚胎组织和人类许多恶性肿瘤组织中表达异常增高［12］。既往研究表明，HMGA2在绝大多数恶性肿瘤中作为癌基因发挥促癌作用［13］。研究已经证实HMGA2 在喉鳞癌细胞和组织中表达异常增高，抑制喉鳞癌细胞HMGA2能够抑制癌细胞的增殖及侵袭能力，并促进其凋亡［14-17］。近期研究发现，miR-204 在结肠癌［18］和甲状腺癌［19］中均能够通过调控HMGA2 发挥抑癌作用。本研究发现，miR-204过表达能够明显抑制Hep-2细胞中HMGA2 蛋白的表达，提示miR-204 过表达对Hep-2 细胞增殖、凋亡、细胞周期及侵袭的影响可能与其对HMGA2蛋白表达的抑制作用有关。

综上所述，miR-204 过表达能够将喉鳞癌Hep-2细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡，其机制可能与其对HMGA2 表达调控有关。这可能成为喉鳞癌的潜在治疗靶点，为临床诊治提供新的方向。