UCH-L3和HIF-1α在乳腺良恶性病变中的表达和临床意义

牛彤旭，王 张，宝鲁日，孙 微，师永红1,

(1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010000；2.赤峰学院，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古医科大学附属医院病理科，内蒙古 呼和浩特 010000)

低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)在调节肿瘤新血管形成及肿瘤细胞生物学能力中具有重要作用。HIF-1的活性主要由HIF-1α 亚基决定，该亚基受细胞内氧气浓度的调节，在缺氧环境下HIF-1α 进入胞核，与HIF-1β结合进而诱导多种靶基因转录和表达，促进血管生成和增加肿瘤细胞对低氧环境的耐受和恶性演进[1]。利用siRNA靶向干扰HIF-1α抑制了细胞的生长和侵袭，促进了细胞凋亡[2,3]。泛素-蛋白酶水解系统是HIF-1α 的主要降解途径，泛素羧基末端水解酶-3(Ubiquitin C-terminal hydrolases L3，UCH-L3)属于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族成员之一，调控泛素-蛋白酶体降解[4]。本课题组前期蛋白学组研究发现UCH-L3是MDA-MB-231细胞HIF-1α 的靶蛋白，受HIF-1α 的负性调控；UCH-L3不仅能促进HIF-1α的降解，还能抵消蛋白酶抑制剂(MG231)对HIF-1α蛋白降解的影响，上调UCH-L3削弱了MDA-MB-231细胞的恶性生物学行为[5]。然而关于两种蛋白在乳腺癌组织中表达的相关性却未见报道。因此，本研究拟从组织学水平检测UCH-L3和HIF-1α 在乳腺癌组织、癌旁乳腺组织和良性病变组织中的表达，分析与乳腺癌临床病理学特征的关系以及两者之间的相关性，从组织学层面验证两种蛋白在人体乳腺癌发生和发展中的可能作用，为乳腺癌提供可能的治疗依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集内蒙古医科大学病理科2016年1月1日～2017年12月31日收治的经病理证实的乳腺癌女性患者99例，年龄30～85岁，中位数55岁。纳入标准: 均行手术治疗; 术前未行抗肿瘤治疗; 具有完整的临床病理资料。其中83例可用我国常见恶性肿瘤诊治规范的乳腺癌分级标准进行组织学分级，I级12例，Ⅱ级47例，Ⅲ级24例。99例乳腺癌组织中选取38例，将乳腺癌组织及其周围距离肿瘤小于3 cm的癌旁非肿瘤乳腺组织进行对比，另选取29例乳腺良性病变(包括纤维腺瘤、腺病、导管普通型增生和导管内乳头状瘤)患者作为对照组，实验符合内蒙古医科大学生物医学科研伦理审批。

1.2 实验抗体与方法

Anti-UCHL3兔单克隆抗体(EPR5332)购置于abcam公司，HIF-1α抗体试剂(ZA-0552)购置于中杉金桥公司，采用免疫组织化学染色法(MaxVesion法)。制作厚度为4 μm的组织切片。UCH-L3兔单克隆抗体按1∶300稀释，HIF-1α为即用型抗体使用罗氏公司的Benchmark XT自动免疫组织化学仪进行染色。

1.3 免疫组织化学染色结果判读

双盲条件下由两位病理医师独立打分。本次实验中UCH-L3表达于细胞质，而HIF-1α 有两种表达形式，一种为细胞核表达，另一种为细胞质表达。免疫组化染色按如下标准分为：UCH-L3和HIF-1α 胞质染色强度0分为细胞未着色、1分为浅黄色、2分为棕黄色、3分为棕色、4分为黑褐色；HIF-1α 胞核染色强度0分为未着色、1分为浅棕色、2分为棕色、3分为棕黑色；染色比例为阳性肿瘤细胞量占肿瘤总细胞量的百分比；最后综合分数=染色强度*染色比例(%)。根据综合分数分为：0分为“阴性”；>0分为阳性，其中包括0.01～0.99分为“”，1～1.99分为“”，2～2.99分为“”，≥3分为“”。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0对数据进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验及Fisher精确概率法，等级资料比较采用Spearman相关分析、Mann-WhitneyU检验和Wilcoxon符号秩和检验，检验水准(α)为0.05。

2 结果

2.1 UCH-L3、HIF-1α 在乳腺癌、癌旁乳腺组织及良性病变组织中的表达

UCH-L3在乳腺癌组织、癌旁乳腺组织和良性病变组织中的阳性表达率分别为84.8%、100.0%和93.1%，乳腺癌组织UCH-L3阳性表达率低于癌旁乳腺组织，差异具有统计学意义(P=0.015)，见表1；经过组间两两对比，癌旁乳腺组织阳性表达率高于乳腺癌组织。乳腺癌组织UCH-L3的表达强度也弱于癌旁乳腺组织和良性病变组织中(P=0.000和P=0.035)，见图1、2和表2。本研究发现HIF-1α染色结果具有两种表达形式，一种为细胞核表达；另一种为细胞质表达。HIF-1α胞核阳性表达率在乳腺癌细胞、癌旁乳腺组织细胞和良性病变组织分别为69.7%、10.5%和10.3%，乳腺癌细胞HIF-1α胞核阳性表达率高于癌旁乳腺组织和良性病变组织(P=0.000)，见图3和表1。同样，HIF-1α 细胞质阳性表达率在乳腺癌组织、癌旁乳腺组织和良性病变组织分别为90.9%、52.6%和79.3%，差异具有统计学意义(P=0.000)，见表1，经过组间两两比较，乳腺癌组织HIF-1α胞质阳性表达率高于癌旁乳腺组织。

表1 乳腺癌、癌旁乳腺组织和良性病变组织中UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞质HIF-1α 阳性表达率的比较

A：乳腺癌组织呈中等阳性表达；B：癌旁乳腺组织呈强阳性表达；C：良性病变组织呈强阳性表达。

图2 UCH-L3在乳腺癌组织呈不同强度表达(IHC 400×)Fig 2 UCH-L3 showed different intensity expression in breast cancer tissues(IHC 400×)

A：乳腺癌组织胞核强阳性，胞质呈中等阳性；B：基底样型乳腺癌组织胞核中强表达，胞质阴性表达；C：癌旁乳腺组织中呈阴性表达；D：良性病变组织胞质弱阳性。

表2 乳腺癌与癌旁乳腺组织和良性病变组织中UCH-L3表达强度的比较

2.2 UCH-L3、HIF-1α表达与临床病理特征的关系

UCH-L3阳性表达率在Luminal 分型中的 A型乳腺癌(100.0%)中明显高于基底样细胞型乳腺癌(73.3%)(P=0.037)；组织学分级为I级乳腺癌(100.0%)的UCH-L3阳性表达率高于Ⅲ级(79.2%)。UCH-L3表达率与年龄、pT、pN、病理分型的差异无关(P>0.05)，见表3。乳腺癌UCH-L3的表达强度与雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)呈正相关(r=0.258，P=0.010和r=0.292，P=0.003)，与人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、Ki-67无相关性(P>0.05)。HIF-1α胞核阳性表达率以Luminal 分型中的HER2过表达型(100.0%)和基底细胞样型乳腺癌(90.0%)高于Luminal A和B型(P=0.000)，见表3。HIF-1α胞核表达强度在乳腺癌与ER、PR呈负相关(r=-0.525，P=0.000和r=-0.438，P=0.000)，与Ki-67和组织学分级呈正相关(r=0.390，P=0.000和r=0.367，P=0.001)。与之相反，HIF-1α胞质阳性表达率却在Luminal分型中以基底细胞样型表达率最低(73.3%)(P=0.003)，见表3。而且，HIF-1α胞质表达强度与ER、PR呈正相关(r=0.299，P=0.003和r=0.359，P=0.000)；与Ki-67、组织学分级呈负相关(r=-0.257，P=0.005和r=-0.281，P=0.010)。HIF-1α胞核表达和胞质表达率在各年龄组、pT组、pN组、病理分型均无显著差别(P>0.05)，见表3。

表3 UCH-L3、胞核HIF-1α 和胞质Hif-1α阳性表达率与乳腺癌临床病理特征的关系

2.3 UCH-L3和HIF-1α 之间的关系

Spearman相关分析显示，UCH-L3仅与HIF-1α 胞质表达强度呈正相关(r=0.226，P=0.008)。

3 讨论

泛素是一种76个氨基酸的蛋白质，在真核生物中广泛分布并高度保守。泛素化与翻译后调控有关，即蛋白质经过泛素偶联，然后通过蛋白水解酶系统降解。泛素结合通过改变靶蛋白的稳定性、定位和/或活性及其动力学来调节靶蛋白的细胞内活性。然而，泛素化可以被DUBs逆转，该酶又分为UCHs和泛素特异性加工蛋白酶(ubiquitin specific processing proteases，USPs)[6]。UCH-L3通过水解与靶蛋白连接的泛素链，使泛素游离出来，进而达到调控靶蛋白降解的作用[7]，参与增殖、分化、凋亡[8]和EMT[9]以及预后[10,11]。本研究发现UCH-L3在乳腺癌组织表达明显低于癌旁乳腺组织或良性病变组织；Luminal分型中的基底细胞样亚型低于Luminal A型，并与ER、PR呈正相关。与本课题组前期体外研究结果相符，即通过病毒表达载体上调乳腺癌细胞细胞系MBA-MB-231的UCH-L3蛋白水平，能够抑制细胞的增殖和生长、迁移、侵袭以及克隆形成能力[5]。这些提示UCH-L3表达的丢失或降低在乳腺癌的发生和演进中的确发挥作用。有研究也显示，高度转移性前列腺癌PC3细胞UCH-L3表达水平降低，非转移性前列腺癌细胞则表达上调，增加PC3前列腺癌细胞UCH-L3的表达，癌细胞侵袭和转移能力下降[12]。

HIF-1α 是具有氧依赖性特点的核转录调控因子[13]。在缺氧条件下，HIF-1α 大量积累于细胞质中，继而转入细胞核，形成HIF复合物，诱导靶基因转录和表达，促进血管生成，改善肿瘤缺氧，增强肿瘤的增殖、侵袭和转移能力[14-16]。在正常氧浓度条件下，HIF-1α 与VHL肿瘤抑制蛋白结合，导致HIF-1α 的泛素化和蛋白酶体的降解[1]。本研究在组织学水平上发现HIF-1α 有细胞核和细胞质两种表达模式，即细胞核表达和细胞质表达；胞核和胞质HIF-1α 在乳腺癌组织的阳性表达率高于癌旁乳腺组织或良性病变组织；然而HIF-1α 的细胞核和细胞质表达模式与乳腺癌临床特征之间的关系相反，如乳腺癌胞核HIF-1α 阳性表达增加多见于Ki-67高表达、HER2过表达亚型和基底样乳腺癌亚型，细胞核表达强度又与ER、PR呈负相关，与Ki67和组织学分级呈正相关；相反，细胞质HIF-1α 表达基底样型乳腺癌中的阳性表达率明显最低，HIF-1α 胞质表达强度又与组织学分级和Ki-67呈负相关，与ER和PR表达正相关。是否细胞质HIF-1α 高表达与其向细胞核转运受抑制有关，其机制尚不清楚。由此可见乳腺癌细胞核HIF-1α 的表达预示着乳腺癌具有更高恶性程度。这与本课题组在乳腺癌细胞系研究结果一致，即降低MDA-MB-231细胞中HIF-1α的表达对细胞生长具有明显的抑制作用[17]，因此HIF-1α 的过表达可能在乳腺癌变和演进过程中发挥作用，HIF-1α 从细胞质进入胞核预示肿瘤的恶性演进。亦有研究表明许多癌组织和转移灶中均有 HIF-1α 的过表达，HIF-1α 阳性表达的甲状腺髓样癌患者，5年总生存率明显降低[18]。与肝细胞癌组织HIF-1α 过表达与低存活率，高复发率和淋巴结高转移率相关[19]。

本课题组前期研究采用双向凝胶电泳结合飞行质谱技术对siRNA干扰HIF-1α后的MDA-MB-231细胞中HIF-1的靶蛋白进行了研究。结果表明，与未经siRNA干扰的细胞相比，蛋白质组学检测到19种下调蛋白和2种上调蛋白，其中的大多数曾被报道为HIF-1的靶蛋白，并首次确定UCH-L3是HIF-1上调的两种差异蛋白之一，这意味着UCH-L3可能是HIF-1的一个新的直接或间接靶点；通过慢病毒转染发现上调UCH-L3降低了MDA-MB-231细胞中游离和泛素结合HIF-1α的表达，并抑制其细胞的生长和克隆性，削弱了细胞的迁移和侵袭能力等恶性生物学行为；UCH-L3不仅能促进泛素从多泛素HIF-1α中分离，进而促进HIF-1α的降解，而且能抵消蛋白酶抑制剂(MG231)对MDAMB-231细胞HIF-1α蛋白降解的影响[5]。而UCH-L3慢病毒过表达载体转染的雌孕激素受体阳性的乳腺癌细胞系MCF-7细胞，却表现出HIF-1α 蛋白水平的升高和恶性生物学行为能力的提高。本次试验从组织学水平上分析了UCH-L3与HIF-1α 的关系，发现UCH-L3表达在基底样型乳腺癌中降低，与细胞核HIF-1α 表达正相反。然而UCH-L3与细胞质HIF-1α表达呈正相关，二者均在基底样亚型最低，可见HIF-1α 由胞质向胞核的迁移不单纯与其含量增加有关，UCH-L3对HIF-1α的调控也因乳腺癌的不同分子分型而异。综上所述，UCH-L3和HIF-1α 对乳腺癌预后的评估具有一定的价值。提高UCH-L3的表达和阻止HIF-1α 由细胞质向细胞核的迁移可为乳腺癌的防治，特别是基底样型乳腺癌提供实验室依据。