茵陈对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂质沉积及p38 MAPK、p62/LC3表达的影响

贾 宁，邵珊珊,2，3，陈文斌,2,3，薄 涛,2,3，赵家军,2,3，方 丽,2,3，何 钊,2,3，高 聆,2,3

(1. 山东第一医科大学附属省立医院，山东 济南 250021；2. 山东省内分泌与脂代谢重点实验室，山东 济南 250021；3. 山东省临床医学研究院内分泌代谢研究所，山东 济南 250021)

非酒精性脂肪肝是脂肪在肝脏的异位沉积导致的一系列肝脏病变，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌，其全球发病率为22.10%～28.65%[1]。非酒精性脂肪肝的病理影响不仅仅限于肝脏，而且涉及人体各个系统，影响慢性疾病如冠心病、高血压、2型糖尿病、肿瘤、慢性肾病等的发生发展[2]。然而目前非酒精性脂肪肝的治疗除了生活方式干预外，并无有效药物获批[3]。茵陈是肝胆系统疾病常用的中药之一，具有保肝、利胆、抗肿瘤、免疫调节等作用[4-5]，其单方用于慢性肝炎的治疗效果较好[6-7]，但对非酒精性脂肪肝的干预作用及机制尚不明确。本实验通过高脂诱导制备非酒精性脂肪肝小鼠模型，探讨了茵陈单方的可能作用机制，为茵陈的临床合理应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 6～8周龄C57BL/6J雄鼠购自北京维通利华公司，于室温22～24 ℃，相对湿度50%～70%，每日12 h日光灯循环照明的环境饲养，自由饮食饮水。动物研究经山东省立医院动物伦理委员会审查批准(2018-011)。

1.2主要试剂及实验设备 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)(深圳，迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，组织三酰甘油(TG)含量测定试剂和组织总胆固醇(TC)含量测定试剂(北京，普利莱基因技术有限公司)，TC测定试剂盒、TG测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(深圳，迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，苏木素、伊红、油红O染色试剂(武汉，谷歌生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(美国，BOSTER)，裂解缓冲液(RIPA+PMSF)、蛋白浓度测定(BCA)法试剂盒(上海申能博彩生物科技公司), 4×蛋白质上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)，磷酸酶抑制剂(美国，Bimake)，抗磷酸化的p38 MAPK激酶抗体(Thr180/Tyr182)(美国，CST，1∶1 000)，抗总p38 MAPK 激酶抗体(美国，CST，1∶1 000)，抗p62抗体(美国，Abcam，1∶1 000)，抗LC3B抗体(美国，CST，1∶1 000)，抗GAPDH抗体(美国，Abcam，1∶7 500)，羊抗兔/羊抗鼠二抗(美国，Jackson ImmunoResearch，1∶5 000)；全自动生化分析仪(日本，奥林巴斯AU5400)，恒冷箱切片机 (德国，徕卡公司，CM1950)，正置荧光显微镜(德国，Zeiss Axio Imager A2)，酶标仪(美国，Molecular Devices公司, Spectra MAX plus 384)，PVDF膜(美国，Millipore公司)，离心机(德国，eppendorf 5810R)，DK-600s型三用恒温冰箱、THZ-312型台式恒温振荡器(上海精宏实验设备)，超纯水仪(英国，ELGA公司，Purelab Classic UF)，电子分析天平(日本，A&D)，Western-blotting电泳仪/电泳槽/转膜槽(美国，Bio-Rad)，化学发光仪(美国，Alpha Innotech，Flurochem Q)。

1.3药物来源及制备 茵陈(绵茵陈)来自山东中医药大学附属医院中药房(河北春开制药有限公司，批号170401209)，依据临床常用药物煎煮方法煎煮，即将干燥茵陈地上部分100 g加蒸馏水1 000 mL室温(25 ℃)浸泡4 h，将浸透的茵陈水煮沸40 min，过滤出水煎液，向残余的药渣中再次加入1 000 mL蒸馏水，煮沸40 min，将两次滤出的水煎液混匀,置通风橱的水浴锅上加热浓缩至1.25 g生药/mL，期间及时排出水蒸气，待晾至室温后分装储存到-80 ℃，灌胃之前用蒸馏水稀释。茵陈用药剂量依据《中华人民共和国药典( 2015年版)》中常用剂量15 g为低剂量、60 g为高剂量,通过人与动物体表面积折算等效剂量换算[8]。

1.4模型建立、分组及干预 42只小鼠适应性喂养1周后，随机选12只为普食组，给予普通饮食(北京科澳协力大小鼠维持饲料)；剩余30只参照文献[9]方法给予高脂饮食(60%kcal 脂肪, 美国Research Diets，D12492)，连续喂养12周建立非酒精性脂肪肝模型，随机筛选3只确定造模成功后，将剩余小鼠随机分为模型组、茵陈低剂量组、茵陈高剂量组，每组9只。茵陈低剂量组和茵陈高剂量组小鼠在高脂饮食同时分别给予茵陈1.95 g/(kg·d)和7.8 g/(kg·d)灌胃，模型组给予高脂饮食同时给予等量蒸馏水灌胃，普食组给予普通饮食同时给予等量蒸馏水灌胃，均每日1次，连续灌胃16周。观察小鼠毛发、进食饮水及活动情况，每周定时称量小鼠体质量、进食量。

1.5样本获取及制备 干预16周末，小鼠禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘取一侧眼球取血，3 000 r/min快速离心10 min，取上清液，分装冷冻保存待检测；分离肝脏组织迅速称重，并在肝右侧最大叶相同位置取2块大小约4 cm×3 cm×2 cm肝组织，一块放4%多聚甲醛固定，另一块液氮冷冻，剩下的肝组织分装后液氮存放。

1.6观测指标与方法

1.6.1血清学指标 冷冻的血清4 ℃过夜，缓慢融化，根据相应试剂说明使用全自动生化仪检测血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.6.2肝脏组织病理学 肝组织经4%多聚甲醛固定24 h后经过脱水石蜡包埋后，切成5 μm石蜡切片，依照试剂盒说明进行HE染色；部分液氮中肝组织制成10 μm冰冻切片，根据试剂说明进行油红O染色，并在苏木素染液中复染3 min；在正置荧光显微镜下观察组织病理结构，每个切片随机选3个视野拍照记录。

1.6.3肝脏病理NAS评分 病理学专家不知道分组的情况下，参照文献[10]对所有HE染色的肝脏病理切片进行评分。脂肪沉积：<5%为0分，5%～33%为1分，34%～66%为2分，>66%为3分；小叶炎症：无炎性灶为0分，<2个炎性灶/200×视野为1分，2～4个炎性灶/200×视野为2分，>4个炎性灶/20×视野为3分；肝细胞气球样变：无为0分，很少为1分，明显或许多为2分。

1.6.4肝组织中TG和TC含量 快速称取30 mg肝组织至高压消毒过的1.5 mL EP管中，剪碎组织，加入1×PBS(组织用)1 000 μL洗涤3次，4 ℃下12 000×g离心1 min后弃上清，按照组织TG和组织TC含量测定试剂盒内说明书加入相应的裂解液各350 μL，用组织破碎仪制成肝脏匀浆，4 ℃下12 000×g离心15 min，取上清用BCA法测定蛋白质的含量，沉淀物70 ℃水浴10 min，再次12 000×g离心15 min，取上清，按照测定试剂盒内说明书测定组织中TG和TC含量。测得OD值用相应的蛋白含量进行校正后再进行比较。

1.6.5肝组织中磷酸化p38(p-p38 MAPK)、总p38(p38 MAPK)、p62及LC3蛋白表达情况 每组随机选3只，采用Western blot法检测：快速称取30 mg肝组织至高压消毒过的1.5 mL EP管中，剪碎组织，加入1×PBS(组织用)1 000 μL洗涤3次，4 ℃下12 000×g离心1 min后弃上清，按照蛋白提取试剂盒说明提取蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液(3∶1)，100 ℃×10 min水浴变性。配置10% SDS电泳凝胶，将相同蛋白量的蛋白加入凝胶的梳孔中，进行电泳，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入以下抗体4 ℃过夜：抗磷酸化的p38 MAPK激酶抗体，抗总p38 MAPK 激酶抗体，抗p65抗体，抗LC3B抗体，抗GAPDH抗体，第2天1×TBST洗膜 5 min×4次，加入相应的二抗(兔抗或鼠抗)，室温孵育1h，再次1×TBST洗膜 5 min×4次，用化学发光法检测印记蛋白，并用显影成像分析系统分析。使用Alpha-Q 软件进行灰度分析，用同一张膜上GAPDH灰度值校正靶蛋白水平。实验重复3次。

2 结 果

2.1各组小鼠体质量、进食量、肝脏外观比较 实验过程中，各组小鼠进食活动情况良好，未见异常死亡。与普食组比较，模型组、茵陈低剂量组、茵陈高剂量组小鼠体质量均明显增加(P均<0.05)，此3组小鼠体质量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图1。4组小鼠每日进食量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图2。与普食组比较，模型组、茵陈低剂量组、茵陈高剂量组小鼠肝脏弥漫性肿大，色泽偏黄，表面油腻感，边缘变钝；茵陈干预组较模型组小鼠肝脏肿大程度轻，色泽红润，其中茵陈低剂量组改变较轻，见图3。

图1 各组小鼠实验过程中体质量变化

图2 各组每只小鼠每日平均进食量

2.2各组小鼠血清生化指标比较 模型组小鼠血清ALT、AST、TC、LDL-C、HDL-C水平均明显高于普食组(P均<0.05)；茵陈低剂量组和茵陈高剂量组血清ALT水平均明显低于模型组(P均<0.05)，AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

图3 各组小鼠肝脏大体形态

表1 各组小鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.3各组小鼠肝脏组织病理学表现 HE染色显示，模型组肝细胞肿胀，肝内广泛分布脂滴空泡，部分肝细胞内可见气球样变及少量炎性小体，茵陈干预组肝细胞肿胀减轻，脂滴空泡减少，其中茵陈低剂量组较高剂量组改善明显，见图4。油红O染色显示，模型组肝细胞内可见红染的脂滴，数量多、体积大，茵陈干预组脂滴数量、体积较模型组减少及缩小，其中茵陈低剂量组较高剂量组改善明显，见图5。

图4 各组小鼠肝脏组织病理学HE染色表现(×200)

图5 各组小鼠肝脏组织病理学油红O染色表现(×100)

2.4各组小鼠肝脏组织病理学NAS评分 模型组小鼠肝脏脂肪变性积分、肝细胞气球样变积分均明显高于普食组(P均<0.05)，茵陈低剂量组均明显低于模型组(P均<0.05)，茵陈高剂量组与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；各组小鼠肝小叶炎症积分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图6。

图6 各组小鼠肝脏组织病理学NAS评分

2.5各组小鼠肝脏组织中TG和TC含量 模型组小鼠肝脏组织中TG、TC含量均明显高于普食组(P均<0.05)；茵陈低剂量组TG含量明显低于模型组和茵陈高剂量组(P均<0.05)，茵陈高剂量组TG含量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、茵陈低剂量组、茵陈高剂量组间TC含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图7。

图7 各组小鼠肝脏组织中TG和TC含量

2.6各组小鼠肝脏组织中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p62、LC3蛋白表达情况 模型组小鼠肝脏组织中p-p38 MAPK、p62、LC3蛋白表达水平均明显高于普食组(P均<0.05)；茵陈低剂量组小鼠肝脏组织中p-p38 MAPK、p62蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，LC3蛋白表达水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图8～10。

图8 各组小鼠肝脏p-p38 MAPK及p38 MAPK表达情况(每组随机抽取3只小鼠，每一条带代表1只小鼠)

3 讨 论

TG在肝脏的异位沉积在非酒精性脂肪肝发展过程中属于相对“良性”“缓慢”的病理阶段，因而临床常常容易被忽视，但此阶段是非酒精性脂肪肝后续病理变化的基础[11-12]，在此时进行积极的临床干预能有效防止非酒精性脂肪肝不良结局的发生。基于此，本研究选择高脂诱导非酒精性脂肪肝小鼠模型，基本复制了临床非酒精性脂肪肝第一阶段即单纯性脂肪肝阶段，并通过NAS评分对非酒精性脂肪肝向脂肪性肝炎进展进行评估，结果发现，茵陈单方能有效减少肝脏TG的沉积，延缓非酒精性脂肪肝进展，且低剂量优于高剂量。

图9 各组小鼠肝脏组织中p62蛋白表达情况(每组随机抽取3只小鼠，每一条带代表1只小鼠)

图10 各组小鼠肝脏LC3蛋白表达情况(每组随机抽取3只小鼠，每一条带代表1只小鼠)

茵陈又称“白蒿”，《神农本草经》将其归于上品，谓其“味苦平”“主风湿寒热邪气，热结黄疸，久服轻身益气耐老”，《本草正义》谓其“为利湿清热专品，乃湿热发黄之主药”，《中药学》将其功效总结为“清热利湿，利胆退黄”，然而查阅古籍发现茵陈功效并不拘泥于此。例如吴鞠通在藿香正气散加减方中“三焦湿郁，升降失司，脘连腹胀，大便不爽”之证加用茵陈，注言“茵陈宣湿郁而动生发之气”；又如张锡纯在《医学衷中参西录》治疗肝阳上亢之类中风初时以龙骨、牡蛎、龟板、芍药等镇肝熄风，有患者服后有觉气血上攻而加剧者，加用茵陈、麦芽、川楝子后症状缓解，张锡纯认为“肝为将军之官，其性刚果，若但用药强制，或转激发其反动之力”，此处加茵陈，因其“得初春少阳生发之气，与肝木同气相求，泻肝热兼舒肝郁，实能将顺肝木之性”，因此，茵陈又有理气开郁、宣发湿气之功。由此，茵陈可升可降，清轻主升，味苦主降，“理气开郁，宣发湿气”体现其生升之性，“清热利湿，利胆退黄”体现其降泄特性，然而其升降之性是如何体现的呢？翻阅古籍发现，茵陈功效的不同体现，除与药剂配伍有关外，跟剂量大小密不可分。例如，《伤寒论》治疗湿热黄疸经典方剂“茵陈蒿汤”，茵陈六两清利湿热，按古今度量衡折算[13]相当于现代剂量约93.72 g。《医学衷中参西录》镇肝熄风汤中茵陈二钱，疏肝开郁，仅相当于现代剂量7.46 g。此外，现代医家在临证中亦发现茵陈剂量不同其功效各异[14]， 因此，茵陈单方应用时应注意其量效关系，大剂量性偏降，小剂量性偏升。本研究发现茵陈低剂量组肝脏病理改变较茵陈高剂量组轻，肝脏组织中TG含量明显低于茵陈高剂量组，可见茵陈对非酒精性脂肪肝主要通过理气开郁、宣发湿气功效发挥作用，由此反推非酒精性脂肪肝的中医证型当以肝气郁结、湿浊内蕴为主，这与现代医家基于数据挖掘对非酒精性脂肪肝病性证素认识一致[15]。

非酒精性脂肪肝是一种慢性进展性疾病，其发病机制复杂，近年来越来越多的研究表明炎症反应和自噬在非酒精性脂肪肝的发生发展过程中起着重要作用[16-18]。p38 MAPK是促进炎症因子产生的主要因子，也是介导细胞自噬的重要效应因子，研究发现p38 MAPK在脂多糖(LPS)刺激下通过酪氨酸磷酸化而被激活，刺激NF-κB、TNF-α、IL-6等促炎因子分泌，引起细胞损伤，促进非酒精性脂肪肝进展为脂肪性肝炎[19]。此外，p38 MAPK通过调节p62表达参与细胞自噬[20]，p62是一种泛素化蛋白和选择性自噬底物，在各种因素刺激下与泛素化蛋白聚体堆积作为底物参与自噬[21]，而LC3是自噬体标记分子，能在自噬小体形成前识别胞质内的废物以激活自噬[22]，二者是自噬过程中最为关键的因子。本研究发现，高脂喂养小鼠肝脏组织中p-p38 MAPK、p62、LC3表达增加，提示小鼠肝脏p38 MAPK通路被激活，引发炎症反应，p62泛素化蛋白聚体不断形成，但不能被LC3识别而分解，因此自噬过程受到抑制；低剂量茵陈干预后，小鼠肝脏组织中p-p38 MAPK、p62蛋白表达水平降低，LC3蛋白表达水平有增高趋势，说明小剂量茵陈干预能减轻肝脏内炎症反应，激活肝脏自噬过程，从而促进脂质分解，减少TG沉积。

综上所述，低剂量茵陈能减少高脂诱导的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏TG沉积，延缓非病情进展，茵陈对非酒精性脂肪肝的治疗作用可能与激活p38 MAPK通路，促进自噬有关，为茵陈的临床合理应用提供了一定依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。