置丰富环境中饲养的三叉神经病理痛小鼠行为学、脑组织终板床核活动度观察

刘婷婷，孙晓羽

1 辽宁省人民医院，辽宁沈阳110000；2 脑科学研究院神经生物教研室

三叉神经病理痛是临床最常见的慢性痛［1］，病程较长，约50%的三叉神经病理痛患者并发焦虑、抑郁等精神疾患［2］。因此，临床工作者更应关注三叉神经病理痛诱发的负性情绪。终纹床核又叫扩展杏仁核，位于基底前脑［3］。有研究表明，激活终纹床核可引起焦虑行为［4］。更有研究发现，终纹床核调控甲醛诱发的痛厌恶情绪［5］。终纹床核是否参与神经病理痛仍不清楚。既往研究证实，丰富环境可影响海马神经元突触和细胞的生物活性，从而改善疼痛和抑郁行为［6-7］，但对终纹床核的影响尚不可知。眶下神经卡压术为三叉神经病理痛动物模型建立的常用方法［8-9］。2018年12月—2019年4月，我们采用眶下神经卡压术建立三叉神经病理痛小鼠模型，观察丰富环境对三叉神经病理痛小鼠行为的改善作用及终纹床核的影响，从而为“丰富环境理念”向临床转化提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器 野生型C57BL/6J 小鼠8 周（购于中国科学院上海实验动物中心），体质量约25 g。抗FosB 抗体（（abcam，ab11959，1：1000）），Alexa Fluor488 二抗（（Invitroge A-21202，1：200），正常驴血清（Sigma-Aldrich，D9663）。von-Frey fila‑ments（Stoelting），恒温箱冰冻切片机（Leica），动物运动轨迹跟踪系统（Noldus），激光共聚焦扫描显微镜（Olympus）。

1.2 小鼠分组、三叉神经病理痛小鼠模型的建立及在丰富环境中饲养 将23 只野生型C57BL/6J 小鼠随机分3 组：丰富环境组（n=8）、标准环境组（n=9）、sham 组（n=6），所有实验动物饲养温湿度可控的条件下，同时保证12 h光照、充足的饮食。该实验通过复旦大学上海医学院实验动物伦理委员会批准（批号：SYXK 2009-0082）。丰富环境组、标准环境组均采用眶下神经卡压术建立三叉神经病理痛小鼠模型：小鼠按照50 mg/kg的剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉动物，待动物深反射消失，用碘伏消毒动物左侧面颊的皮肤，暴露口腔，平左侧第一磨牙旁黏膜处，钝性分离口腔黏膜，用玻璃钩针暴露眶下神经，将5-0 羊肠线从神经下方穿出，撤走分离钩针后打结，使打好的结搭在神经上，还纳神经至原位。用组织胶封闭创面，把小动物放置在小太阳处，待苏醒后放回动物房。术后丰富环境组小鼠采用丰富环境箱［丰富环境箱的体积为100 cm×50 cm×75 cm（长×宽×高），笼内有两个滚轮，一个长隧道，各种颜色的木质玩具，每2～3天更换玩具以保持新奇感］饲养，每笼5 只，饲养35 d；标准环境组小鼠采用标准环境箱（为正常小鼠笼，体积为29 cm×17.8 cm×16 cm，箱内仅给小鼠提供饲料和水）饲养，每笼5 只，饲养35 d；Sham 组仅钝性分离口腔黏膜，然后采用标准培养箱饲养35 d。

1.3 各组行为学测试 小鼠眶下神经卡压造模第35 d 行动物行为测试。①机械痛敏阈值：采用vonfrey 测试。实验前3 d，每只小鼠在实验员手中适应30 min，同时用von Frey测试棒靠近面部但不进行测试。正式测试时，保持周围环境安静，待小鼠在实验员手中温顺后再进行测试。选取0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6 g 的von Frey 纤毛，按照从小到大的方式作用于手术同侧触须垫的皮肤上。当纤毛弯曲至90º，停留2 s，动物出现快速而明显的撤退反应作为阳性指标。不同度量值的纤毛测试5次，出现3次阳性反应时，所对应的纤毛克数即作为机械痛敏的阈值，阈值越低，痛敏越严重。②焦虑水平测试：分别采用矿场行为测试（OF）及高架十字迷宫（EPM）。所有的情绪相关行为测试前，动物需要预先适应环境至少30 min。维持室内温度在24 ℃并有良好的通风。在一个正方形的测试箱（40 cm×40 cm×30 cm，长×宽×高）中，把该区域平均分成16 个正方形，中间4 个正方形称中心区域。测试时，实验者手托小鼠并温柔地把动物放在旷场的中心区域，通过视频跟踪系统（Ethovision XT v11.5，Noldus BV）记录动物5 min 内的运动情况。以动物在旷场中心区域停留时间作为反映焦虑水平的指标，停留时间越短，动物越焦虑。高架十字迷宫由四个相互垂直的臂（6 cm×35 cm）和中央平台区（6 cm×6 cm）组成，距离地面50 cm，其中闭合臂高20 cm。测试时，实验者手托小鼠并温柔地把动物放在面朝开臂的中央平台的位置。通过视频跟踪系统（Ethovision XT v11.5，NoldusBV）记录动物在5 min 内的运动轨迹。以动物在开臂停留的时间和进入开臂的次数作为反映焦虑水平的指标，开臂中停留时间越短、进入次数越少，代表动物越焦虑。③抑郁水平测试：悬尾实验（TS）装置是一个正方形的塑料箱（30 cm×30 cm×30 cm，长×宽×高）。在箱体顶部中央的位置固定一个铝制吊杆。测试时，在距离动物尾巴末端1 cm 的位置粘贴医用胶布，测试时将动物悬挂在铝制吊杆上，保证动物鼻尖距离箱体底部2～3 cm。利用摄像机记录6 min 动物在悬尾箱的活动情况。测试结束后温柔地把动物从吊杆上取下。分析视频后4 min内的不动时间，不动时间越长，动物越抑郁。

1.4 各组脑组织终板床核中delta FosB阳性细胞计数 行为测试后，4%甲醛灌注取脑组织，蔗糖梯度脱水后，OCT 包埋，-80 ℃的冰箱速冻。组织复温切片，厚度35 μm。将收集到的脑组织放在24 孔板内，PBS 溶液冲洗3 次（10 min/次），10%正常驴血清和0.3% Triton X-100 的0.01 mol/L PBS 溶液室温封闭2 h。anti-FosB 抗体（abcam，ab11959，1∶1 000），4 ℃过夜。次日，PBS 溶液冲洗3 次，然后孵育Alexa Fluor 488（Invitroge A-21202，1∶200），4 ℃2 h，PBS溶液洗3 次。封片，激光共聚焦荧光显微镜（FV1000，Olympus）进行图像采集和处理，手动计数×20倍视野下delta FosB细胞数。

1.5 统计学方法 采用Graphpad6.01 软件进行统计分析。计量资料以表示，比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组行为学改善情况 丰富环境组、标准环境组、Sham 组小鼠机械痛敏阈值分别为（0.1038 ±0.01647）、（0.0133 3 ± 0.002 2）、（0.286 7 ±0.0510 3）g，与Sham 组比较，标准环境组机械痛敏阈值降低（P<0.0002）；与标准环境组小鼠比较，丰富环境组小鼠机械痛敏阈值升高（P<0.05）。

在OF测试中，与Sham 组相比，标准环境组小鼠中心停留时间缩短（P<0.0001），其中两组总距离比较，P>0.05；与标准环境组比较，丰富环境组中心停留时间延长（P<0.01）。EPM 测试中，与sham 组相比，标准环境组总距离缩短，开臂停留时间、开臂穿越次数减少，表现出明显的焦虑样行为（P<0.01）。丰富环境组在OF、EPM 测试中无焦虑样表现（P>0.05）；在TS 测试中，标准环境组较Sham 组的不动时间延长，出现行为绝望样的抑郁表现（P<0.0001）；与标准环境组比较，丰富环境组不动时间缩短，绝望行为略有改善（P<0.05）（见表1）。

表1 3组小鼠焦虑、抑郁情况

表1 3组小鼠焦虑、抑郁情况

组别丰富环境组标准环境组Sham组n 8 9 6 OF总距离（cm）1 565±112.1 1 437±170.4 1 815±210.5 OF 中心停留时间（s）25.62±2.82 7.59±2.07 30.23±3.80 EPM总距离（cm）1 394±122.8 1 146±124.8 1 724±184.5 EPM 开臂停留时间（s）35.38± 2.98 16.85± 4.65 53.58±13.55 EPM 穿越次数（次）2.5±0.76 2.0±0.55 5.0±1.00 TS（s）120.9± 8.60 164.3± 8.95 87.3±10.12

2.2 三组脑组织终纹床核中delta FosB 阳性细胞数 丰富环境组、标准环境组、Sham 组终纹床核处delta FosB 阳 性 细 胞数 分 别 为（81.20 ± 3.26）、（310.90 ± 8.98）、（71.30 ± 2.36）个/HP，与Sham 组相比，标准环境组终纹床核处delta FosB阳性细胞数增加（P<0.01）；与标准环境组比较，丰富环境组终纹床核处delta FosB阳性细胞数减少（P<0.05）。

3 讨论

三叉神经痛主要表现为三叉神经分布区突发短暂的电击样疼痛，三叉神经痛作为临床上常见的慢性疼痛，常合并焦虑抑郁样症状，与此同时，焦虑抑郁等心理疾患反过来又加重病痛［8-10］。三叉神经痛发病机制包括神经根受压或牵拉、脑干功能紊乱、基底节或皮层痛觉调节异常，但最广为接受的是神经血管学说。本实验通过眶下神经卡压术模拟三叉神经痛，35 d后引起标准环境组小鼠von-frey机械痛阈值降低，OF中心区停留时间缩短，EPM总距离降低，开臂停留时间缩短，开臂穿越次数减少，出现焦虑样表现。TS 测试中不动时间延长，表现出抑郁样行为。以上实验结果表明神经卡压术后引起小鼠痛敏化、焦虑抑郁的发生。通过35 d的丰富环境干预，丰富环境组小鼠痛敏、焦虑抑郁样症状减轻。我们推测，丰富环境的干预可能改善了三叉神经痛小鼠皮质、皮质下结构的功能。

大量研究表明，终纹床核是边缘皮质重要组成部分，直接影响下丘脑—垂体—肾上腺轴，参与恐惧、焦虑、应激等精神行为活动［11-12］。我们通过免疫组织化学染色发现，眶下神经卡压引起标准环境组终纹床核delta FosB 细胞数的表达增加，再次验证终纹床核在慢性应激中发挥着重要作用［13-16］。丰富环境组小鼠在丰富环境干预后，终纹床核delta FosB的细胞数表达减少，终纹床核活跃性降低。由此推测，终纹床核参与神经病理痛的发病过程，丰富环境通过影响终纹床核的功能从而改善慢性痛及相关的负性情绪。

丰富环境在神经系统疾病中的积极作用得到广泛证实［17］。丰富环境可增加动物的社交和探险行为，提高海马脑源性神经营养因子、环腺苷反应元件结合蛋白、基质细胞源性因子-1，改善海马炎症反应和神经再生［18-20］。暴露于丰富环境的大鼠可降低扣带皮层、海马、下丘脑前部和背内侧、中缝背核的delta FosB 蛋白免疫活性。终纹床核又视为海马、室旁核精神环路的中心，我们同样发现，丰富环境减少了终纹床核delta FosB 的表达，缓解了眶下神经卡压引起的痛敏和负性情绪，提示丰富环境可能是通过抑制终纹床核改善眶下神经卡压引起的痛敏，焦虑抑郁样症状。

综上所述，置于丰富环境中的三叉神经病理痛小鼠慢性痛敏化和焦虑抑郁行为改善，终纹床核活跃度降低。疼痛是感觉和精神两个维度构成的共存病［21-22］。终纹床核在神经病理痛方面的研究相对局限，终纹床核不同的细胞亚群，投射在调控三叉神经病理痛中发挥怎样的作用仍不清楚，需进一步探讨。