甲状腺癌组织中泛素羧基端水解酶5的表达观察

张小丽，海涛，刘文清，李非

首都医科大学宣武医院，北京100053

甲状腺癌是最常见的头颈部和内分泌系统恶性肿瘤，2018 年全球新发病例约为56.7 万例，中国2016 年甲状腺癌发病率、病死率分别为3.1/10 万、0.4/10 万［1-2］。根据病理类型甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌，其中乳头状癌约占90%［3］。早期手术切除联合术后TSH 抑制治疗是临床治疗甲状腺癌最常见的手段，除未分化癌和髓样癌5 年生存率较差以外，其余类型甲状腺癌大部分患者预后均较好，5年生存率可超过90%［4］。但是，部分甲状腺癌患者确诊时恶性肿瘤已侵袭周围组织并发生远处转移，进而导致患者预后不良及术后复发。目前，临床诊断甲状腺癌主要通过甲状腺超声检查、针吸细胞学等手段，但是假阴性率较高［5］。随着分子生物学技术的快速发展，寻找有效的分子肿瘤标志物辅助临床诊断恶性肿瘤及判断病情成为研究热点。泛素羧基端水解酶5（UCHL5）是位于26S 蛋白酶体19S 调节亚基上的泛素羧基末端水解酶异构体，主要调控人体中蛋白质的泛素化，参与蛋白质的代谢、功能、调节、降解等过程［6］。研究显示，UCHL5 表达上调参与了卵巢癌、胃癌等恶性肿瘤的发病过程，并与病情进展密切相关［7-8］。关于UCHL5 与甲状腺癌的关系，相关研究报道相对较少。本研究检测了甲状腺癌组织中UCHL5 表达水平，并探讨了其在甲状腺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014 年6 月-2017 年6 月首都医科大学宣武医院收治的92 例甲状腺癌患者为研究对象。纳入标准：①影像学检查结合术后组织标本病理活检证实为原发性甲状腺癌，并符合《2010年版甲状腺肿瘤治疗指南》［9］诊断标准；②首次确诊并初次手术治疗的患者，手术均由本院同一团队完成；③术前患者未接受过任何放、化学治疗；④预计生存时间>6 个月者，术后均进行常规规范治疗；⑤年龄18～75 岁者；⑥临床病历资料完整且配合随访的患者。排除标准：①妊娠期及哺乳期的女性患者；②合并其他甲状腺疾病的患者；③合并其他分泌性疾病的患者；④手术禁忌证患者；⑤合并其他恶性肿瘤的患者。取手术切除的甲状腺癌组织为甲状腺癌组，同一患者的癌旁组织（距癌灶边缘>5 cm）为癌旁组。本研究得到医院伦理委员会的批准。

1.2 组织中UCHL5 的检测 术后利用RNAiso Plus（购自于日本TaKaRa 公司）提取手术切除的新鲜病理癌组织及癌旁正常组织标本中的总RNA，操作过程参照说明书进行，紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度，当OD260/280在1.92.1 范围内提示RNA纯度较高，可以进行下一步的反转录，采用无核酸酶水将1 μg RNA 稀释至1 mL，采用SYBR Premix Ex Tap II Kit 反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）将cRNA 反转录合成为cDNA。采用7500 荧光定量PCR 仪（购自于Applied Biosystems 公司）检测UCHL5 mRNA 表达水平，首先以cDNA 为模板进行扩增，上游引物序列：5’-TTCGATGTCTCTAGGGTG‑GC-3’，下游引物序列：5’-GATCCACCTCTCGCTCT‑CAG-3’，长度为114 bp；β-Actin为内参，上游引物序列：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物序列：5’-CTAAGTC ATAGTCCGCCTAGAA-3’，长度为51 bp。上述引物序列由上海生工公司合成。RTqPCR 反应体系为20 μL：其中10 μL 的SYBR Green Mix，分别有0.8 μL 的正向引物和反向引物，0.4 μL的Rox，1 μL 的cDNA，7 μL 的RNase-free 无酶蒸馏水。反应条件：95 ℃预变性、持续时间30 s，95 ℃变性、持续时间5 s，60 ℃退火、持续时间30 s，共计循环40 次；溶解阶段：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。UCHL5表达量以2-ΔΔCT表示。

1.3 随访 采用门诊复查方式对术后患者进行随访，随访内容包括术后B 超、CT 等影像学检查，术后1 年每3 个月随访一次，1 年后每半年随访一次。随访截至2020 年6 月，随访时间3～6（4.28 ± 1.07）年。随访终点为经B 超或CT 等影像学检查诊断为甲状腺癌复发或转移；无瘤生存时间是指手术切除后，体内无肿瘤病灶，直至肿瘤复发、转移、死亡的时间。

2 结果

2.1 甲状腺癌组织及癌旁组织中UCHL5 mRNA 相对表达量比较 甲状腺癌组织中UCHL5 mRNA 相对表达量为0.137 ± 0.052，癌旁组织中UCHL5 mRNA 相对表达量为0.086±0.045，甲状腺癌组织中UCHL5 mRNA 相对表达量高于癌旁组织（t=3.926，P<0.05）。

2.2 甲状腺癌组织中UCHL5 mRNA 与患者临床病理参数的关系 肿瘤直径>2 cm、AJCC 分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的甲状腺癌患者病灶组织中UCHL5 表达水平高于肿瘤直径≤0.8 cm、Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的甲状腺癌患者（t 分别为3.093、4.695、3.409，P 均<0.05）；不同性别、年龄、病理类型甲状腺癌患者病灶组织中UCHL5 表达水平差异无统计学意义（t 分别为1.782、1.876、0.702，P 均>0.05）。甲状腺癌组织中UCHL5 mRAN 与患者临床病理参数的关系见表1。

表1 甲状腺癌组织中UCHL5 mRAN与患者临床病理参数的关系

2.3 甲状腺癌组织UCHL5 表达与患者预后的关系 以甲状腺癌患者病灶组织中UCHL5 表达水平的中位数（0.132）为临界值，将患者分为UCHL5 高表达患者（n=38）和低表达患者（n=54），UCHL5 高表达 患 者1、2、3 年 复 发 分 别 为5（13.16%）、17（44.74%）、22 例（57.89%），UCHL5 低表达患者1、2、3 年复发分别为8（14.81%）、13（24.07%）、19 例（35.19%）；UCHL5高表达患者2年、3年复发率高于UCHL5 低表达患者（P 均<0.05），UCHL5 高表达和低表达患者1 年复发率比较，P>0.05。UCHL5 高表达患者无瘤中位生存时间为29.6 个月（95%CI：28.0～31.2），UCHL5 低表达患者无瘤中位生存时间为32.8 个月（95%CI：30.9～34.7），UCHL5 高表达患者无瘤中位生存时间少于UCHL5 低表达患者（P<0.05）。UCHL5 高表达和低表达患者生存曲线见图1。

3 讨论

图1 UCHL5高表达和低表达患者生存曲线

甲状腺癌约占全身恶性肿瘤的1%，虽然在我国的发病率较欧美国家低，但是仍以每年4%的速度增长，绝对死亡人数不断上升，严重威胁患者健康和生命质量［10］。甲状腺癌发病初期无特异性临床症状和体征，大部分患者确诊时已近中晚期，出现了肿瘤侵袭周围组织和局部淋巴结转移［11］。寻找有效手段早期诊断甲状腺癌并评估病情进展，对临床制定针对性治疗措施改善患者预后、延长生存时间具有重要价值。

泛素化是指在泛素激活酶、降解酶、结合酶等作用下，泛素将细胞内的蛋白质分类并选出靶蛋白分子进行特异性修饰的过程，泛素化参与调控蛋白质代谢、调节和降解过程，以及细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、炎症免疫、心血管疾病、恶性肿瘤发生发展等病理生理活动［12］。去泛素化则是在去泛素化酶的介导下降低底物蛋白的多聚泛素化，属于蛋白翻译后的修饰过程。泛素C 末端水解酶为去泛素化酶，可水解多聚泛素链成为游离的泛素单体，加速泛素链的解聚以及泛素的循环，同时还能使泛素化逆转［13］。UCHL5是由223个氨基酸组成的相对分子质量约为24.8 kD 的泛素C 末端水解酶异构体，通过调控蛋白质的泛素化参与了多种恶性肿瘤的发生发展［14］。丁芳等［15］研究显示，乳腺癌裸鼠模型组织中UCHL5 表达上调，并且与总生存时间、无复发生存时间呈负相关，敲低UCHL5表达可抑制恶性肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。研究显示，UCHL5 在结直肠癌、胰腺导管腺癌中表达下降，并且降低越显著，其预后越差［16-17］。此外，UCHL5 还介导了胃癌［18］等恶性肿瘤的发病过程，并与临床病理特征密切相关。上述研究证实，检测UCHL5的表达可反映恶性肿瘤的进展和患者预后情况，并可作为评估治疗效果的靶向指标。

本研究结果显示，甲状腺癌组织中UCHL5相对表达量高于癌旁组织，提示UCHL5表达上调参与了甲状腺癌发病过程。B-Raf 原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（BRAF）为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因家族成员，在甲状腺癌中的突变率为77.8%，该基因的外显子V600E 突变可增强BRAF 活性，进而导致甲状腺癌发生，UCHL5表达上升可促进BARF表达，进而诱发甲状腺癌［19］。此外，UCHL5 通过影响泛素-蛋白酶系统的降解而上调β-catenin 表达，可诱导激活肿瘤基因如cyclinD、c-Jun、c-myc 等促使肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等的发生，UCHL5 参与甲状腺癌的发病过程可能与上述机制有关，但是有待进一步研究。临床通过评估肿瘤分期、淋巴结转移及浸润等病理特征可判断病情的进展，同时也能预测患者预后。任力等［20］的研究表明，肺癌患者UCHL5表达越高，肿瘤分化越差。本研究显示，肿瘤直径>2 cm，AJCC 分期III～IV 期及有淋巴结转移的患者UCHL5表达水平明显高于肿瘤直径≤2 cm、I～II 期、无淋巴结转移的患者，提示UCHL5与甲状腺癌患者临床病理特征密切相关，可能参与了甲状腺癌发生发展过程。进一步研究显示，UCHL5 高表达患者2 年、3 年复发率高于低表达患者，生存分析结果显示，UCHL5 高表达患者无瘤中位生存时间少于低表达患者，表明组织中UCHL5表达与甲状腺癌患者预后有关，UCHL5 相对表达量越高则甲状腺癌患者预后越差，复发率越高，无瘤生存时间越短。因此，早期检测甲状腺癌病灶组织中UCHL5 表达水平有可能可辅助预测患者预后。

综上所述，UCHL5 表达上调参与了甲状腺癌的发生发展过程，并与甲状腺癌的肿瘤直径、AJCC 分期、是否淋巴结转移及预后密切相关。本研究为单中心回顾性研究，样本量相对较小，同时未考虑更多可能影响患者预后的因素如手术方式、患者术后用药等，因此所得结论尚需进一步验证，相关机制有待基础研究予以证实。