miR-29c和NASP在非小细胞肺癌细胞中的表达、对后者生物学行为影响及靶向关系预测验证

王方炜，李超乾

广西医科大学附属第一医院，广西南宁532000

肺癌是常见的一种肿瘤，因其高发病率和病死率受到人们的关注。非小细胞型肺癌是最常见的肺癌，大多数患者发病时已在晚期，错过了治疗机会，因此阐明肺癌发生发展的分子机制，寻找新的分子标志物具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一类在转录后水平负调控基因表达的小非编码RNA，在调控细胞的分化、生长和转移过程中具有重要作用［1-3］，miR-29c 属于miR-29 家族的成员，有研究指出，miR-29c 在非小细胞肺癌中低表达，过表达miR-29c 可抑制肺癌细胞的增殖迁移、侵袭能力［4-7］，但其具体的作用机制尚不完全清楚。细胞核自身抗原精子蛋白（NASP）是一种组蛋白伴侣，参与肿瘤的发生发展。有研究提出，敲低NASP 可抑制胃癌细胞的增殖迁移、侵袭能力，但NASP 是否在非小细胞型肺癌中发挥作用尚不清楚，并且mir-29c是否通过靶向作用于NASP 从而调控非小细胞肺癌细胞的生物学行为目前尚未见报道。2019 年12 月—2020 年6 月，我们观察了非小细胞肺癌细胞A549 中miR-29c、NASP 的表达变化，探讨了二者对非小细胞肺癌细胞A549增殖迁移侵袭和凋亡的影响，并验证了二者之间的靶向关系，为肺癌的早期诊治提供了新靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞、慢病毒、试剂、仪器 人非小细胞肺癌细胞A549 和人正常肺上皮细胞HBE 均购自ATCC，细胞均用含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5% C02的培养箱中培养。慢病毒购自吉凯；BCA 蛋白定量试剂盒、TRIzol、逆转录试剂盒、荧光素酶报告基因检测试剂盒购于TaKaRa 公司；CCK8 试剂、Transwell 小室、基质胶、RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Sigma 公司；Annexin VFITC/PI 细胞凋亡试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 人非小细胞肺癌细胞A549 和人正常肺上皮细胞HBE 中miR-29c、NASP mRNA 的检测 采用RT-qPCR 法。取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549 和人正常肺上皮细胞HBE，用TRIzol 裂解细胞提取RNA 后，按逆转录盒说明书操作合成cDNA，最后按照RT-qPCR 试剂盒说明书操作检测miR-29c 和NASP mRNA，用2-ΔΔCt表 示miR-29c 和NASP mRNA 的相对表达量。miR-29c 的上游引物为5"-GGGTAGCACCATCTGAAAT-3"；下游引物为5"-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3"；NASP 的上游引物为5"-TCCAGTCCTGCCTTAACCTG-3"，下游引物为5"-GCCACTGCCTCATCATACTG-3"。GAPDH 的 上游引物为5"-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3"，下游引 物 为5"-AGATCCACAACGGATACATT-3"；U6 的上游引物为5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物为5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。

1.3 人非小细胞肺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞HBE 中NASP 蛋白的检测 采用Western blotting法。取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549 和人正常肺上皮细胞HBE，RIPA 裂解后提取总蛋白，BCA 法进行蛋白定量后变性，蛋白上样进行SDSPAGE 分离，之后转至PVDF 膜，封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜。次日洗膜后再用辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育2 h。 结束后加入ECL 发光液显影曝光。 以目的条带灰度值与β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.4 A549细胞的分组及miR-29c、NASP的转染 收集对数生长期的A549 细胞，将细胞分为miR-29c 组（转染miR-29c 过表达序列）、miR-NC 组（转染miR-29c 阴性对照序列）、si-NASP 组（转染NASP 沉默序列）、si-NC 组（转染NASP沉默阴性对照序列）、miR-29c+si-NASP 组（miR-29c 过表达和NASP 过表达阴性对照序列共转染）和miR-29c+NASP 组（miR-29c过表达和NASP 过表达序列共转染），转染成功后用于后续实验。转染12 h 后更换新鲜培养基，在转染48、60、72 h 时分别收集细胞上清病毒溶液。将收集所得病毒溶液合并，将病毒上清与PEG8000 以15∶4 的比例进行混合，4 ℃静置过夜。4 000 g 离心20 min，弃上清，病毒沉淀用RPMI1640 培养基重悬。随后将病毒加入到对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549 中，感染48 h 后，用1 μg/mL 的嘌呤霉素筛选未感染细胞，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，待细胞全部表达绿色荧光时表明慢病毒稳定细胞系构建成功。

1.5 转染miR-29c、NASP 的A549 细胞生物学行为观察

1.5.1 各组A549 细胞增殖活性、凋亡率的测算取适量对数生长期的各组A549 细胞，按5×104个/孔，接种于96 孔板中，加入10 μL CCK8 试剂，37 ℃继续培养1 h，分别在24、48、72、96 h 用酶标仪测定450 nm 波长处测定吸光度（OD）值，每组重复测定3次取平均值，以OD值表示相对细胞增殖活性。

取适量对数生长期的各组A549 细胞，按1×106个/孔，接种于6 孔板中，随后用胰蛋白酶消化离心并收集细胞，PBS 洗3 次，加入500 μL 结合缓冲液，调整细胞密度至1×106/mL，取100 μL 缓冲液至流式管内，分别加入5 μL Annexin V-APC 和10 μL 7-AAD 试剂，混匀后于室温避光孵育5 min，加入结合液，应用流式细胞仪分析凋亡率。

1.5.2 各组A549 细胞的迁移、侵袭个数测算 采用Transwell 法。取适量对数生长期的各组A549 细胞，取2×104个细胞加入上室，加600 μL 含血清的培养基加入下室，置于培养箱中培养24 h后取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS 洗涤3 次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，再用PBS 洗涤数次。显微镜下随机选取5 个视野拍照计数，取平均数。侵袭实验操作步骤按照细胞迁移检测试验，在小室上表面涂抹适当厚度的基质胶，待基质胶干后，后续步骤同迁移实验，显微镜下随机选取5 个视野拍照计数，取平均数。

1.6 miR-29c 与NASP 靶向关系预测、验证 用生物信息学软件TargetScan 预测到miR-29c 与NASP的3’-UTR 端有结合位点，将NASP 的3’-UTR 端互补结合位点突变，构建MUT 荧光素报告载体，同时构建野生型WT 荧光素报告载体采用Lipo‑fectamineTM2000 转染试剂辅助共转染到293T 细胞中，实验分组为NC mimics + h-NASP-wt 组、hsa-mir-29c-3p + h-NASP-wt 组、NC mimics + h-NASP-mu组、hsa-mir-29c-3p + h-NASP-mu 组。根据Dual-Lu‑ciferase®报告基因试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料用表示，比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t 检验。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌细胞A549 与正常肺上皮细胞HBE 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白表达比较 非小细胞肺癌细胞A549 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白相对表达量分别为0.56±0.07、3.95±0.13、2.89±0.12，肺上皮细胞HBE 中miR-29c mRNA、NASP mRNA 及NASP 蛋白相对表达量分别为0.95 ± 0.05、1.06 ± 0.04、0.12 ± 0.03，与肺上皮细胞HBE 比较，非小细胞肺癌细胞A549 中miR-29c mRNA 的表达下降，NASP mRNA 和蛋白表达升高（P 均<0.05）。非小细胞肺癌细胞A549 中，miR-29c 组、miR-NC 组NASP 蛋白表达分别为0.15±0.02、1.15±0.11，两组比较，P<0.05；miR-29c+NASP 组、miR-29c+NC 组NASP 蛋白表达分别为0.90±0.25、0.29±0.04，两组比较，P<0.05。

2.2 不同时间各组A549细胞增殖活性比较 培养24、48、72、96 h，miR-29c 组细胞OD 值分别为0.24±0.06、0.34±0.05、0.44±0.05、0.54±0.05，miRNC 组 分 别 为0.24 ± 0.05、0.40 ± 0.05、0.83 ±0.06、1.24±0.06，与miR-NC 组相比，培养72 h、96 h 时miR-29c 组细胞的OD 值升高（P 均<0.05）。培养24、48、72、96 h，si-NASP 组细胞OD 值分别为0.25 ± 0.02、0.35 ± 0.04、0.44 ± 0.03、0.66 ±0.05，si-NC 组 分 别 为0.26 ± 0.02、0.44 ± 0.03、0.86 ± 0.07、1.21 ± 0.10，与si-NC 组相比，培养48、72、96 h 时si-NASP 组 细胞的OD 值降低（P 均<0.05）。培养24、48、72、96 h ，miR-29c+NASP 组细胞OD 值分别为0.12 ± 0.03、0.20 ± 0.01、0.41 ±0.03、0.65 ± 0.04，miR-29c+NC 组 分 别 为0.12 ±0.01、0.18 ± 0.08、0.28 ± 0.05、0.52 ± 0.06。与miR-29c+NC 相比，培养72 h、96 h 时miR-29c+NASP组细胞的OD值升高（P均<0.05）。

2.3 各组细胞凋亡率比较 miR-29c、miR-NC 组细胞凋亡率分别为5.44% ± 1.12%、1.42% ± 0.07%，两组比较，P 均<0.05。si-NASP 组、si-NC 组细胞凋亡率分别为4.07% ± 0.31%、2.25% ± 0.14%，两组比较，P 均<0.05。miR-29c+ NASP、miR-29c+ NC 组细 胞 凋 亡 率 分 别 为4.03% ± 0.35%、7.89% ±0.41%，两组比较，P<0.05。

2.4 各组细胞迁移个数、侵袭个数比较 miR-29c+NASP 细胞迁移个数、侵袭个数分别为（183.67 ±5.51）、（182.33 ± 5.86）个，miR-29c+NC 组分别为（92.33±4.93）、（86.00±7.00）个，两组比较，P均<0.05。si-NASP 组细胞迁移个数、侵袭个数分别为（99.33 ± 6.03）、（110.33 ± 8.96）个，si-NC 组分别为（204.33±4.93）、（190.67±8.02）个，与si-NC 组相比，si-NASP 组细胞迁移及侵袭个数减少（P 均<0.05）。miR-29c 组细胞迁移个数、侵袭个数分别为（94.67±4.51）、（96.33±6.43）个，miR-NC 组分别为（206.00±6.56）、（196.00±5.29）个，两组比较，P均<0.05。

2.5 NASP、miR-29c 靶向关系预测及验证结果miR-29c 与NASP 存在结合位点，见图1。NC mim‑ics+h-NASP-wt 组、hsa-mir-29c-3p+h-NASP-wt 组、NC mimics+h-NASP-mu 组、hsa-mir-29c-3p+h-NASP-mu组荧光素酶活性值为1.00 ± 0.03、0.61 ± 0.02、1.00 ± 0.04、1.00 ± 0.01。与NC mimics+h-NASPwt 组相比，hsa-mir-29c-3p+h-NASP-wt 组细胞的荧光素酶活性值降低（P<0.01）；NC mimics+h-NASP-mu组与hsa-mir-29c-3p+h-NASP-mu 组细胞的荧光素酶活性值差异无统计学意义；提示NASP 是miR-29c的靶基因。

图1 hsa-miR-29c-3p与h-NASP-3UTR靶位点结合示意图

3 讨论

肺癌是威胁人类生命健康的一种恶性肿瘤。肺癌的主要病理类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%～85%。虽然近年来主要通过外科手术联合放疗、化疗及基因治疗等综合治疗方案，明显提高了肺癌患者的总体生存率，但存在食管癌、脊髓炎等严重的并发症，治疗效果仍不令人满意，预后较差，非小细胞肺癌患者的5 年生存率仍然不容乐观，在发展中国家仍未超过9%，在发达国家仍不足16%，其中伴有远处转移的肺癌患者5 年生存率仅为2%。因此，寻找一种新型的治疗手段尤为重要。

miRNAs为18～22 nt的非编码小RNA，可与下游靶基因mRNA 的3"-UTR 结合，促进其降解或者抑制其翻译，发挥基因调控功能。大量研究表明，miRNA 是一种高度保守的内源性非编码RNA，通过调控靶基因，广泛调控细胞的分化、增殖、代谢等功能，从而参与各种病理生理过程，与许多疾病的发展密切相关。在肿瘤中，表达异常的miRNAs 通过靶向癌基因或抑癌基因，发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用，参与癌变进程的每个阶段。近年大量研究表明，miRNA 与乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌等多种癌症密切相关［1-3］，其中，miR-29c作为miR-29家族的一员，在癌症中异常表达，影响癌症患者的预后［4-6］。ZHAN 等［7］运用RT-PCR 法检测正常肺组织和NSCLC 组织发现，miR-29c 在NSCLC 中低表达。LIU 等［8］在非小细胞肺癌的研究中发现，miR-29c 在NSCLC 组织中的低表达与患者的预后不良有关。已有研究证实，过表达miR-29c 后可降低肺腺癌A549细胞的迁移、侵袭能力，升高其凋亡率，抑制其细胞活力［7］，但其具体机制尚不完全清楚。XU 等［5］发现，miR-29c 在鼻咽癌细胞中低表达，并且过表达miR-29c 后，鼻咽癌细胞的活力和迁移、侵袭能力下降。miR-29c 也可通过调控靶基因，发挥抑癌作用［8］，可通过靶向VEGF 基因，抑制肺癌的进展；在其他癌症中，miR-29c 也可通过调控致癌基因CDK6、CDC42 发挥作用［9-10］。非小细胞肺癌的生长增殖亦受癌基因的调控，孙艳婷等［11］提出沉默PGRN 基因能明显抑制A549 细胞的增殖。李苏霞等［12］发现，沉默PDK1 基因可发挥抑制A549 细胞生长的作用。本研究结果显示，与正常肺上皮细胞HBE 对 比，miR-29c mRNA 在A549 细 胞 中 表达 下降。在A549 细 胞 中 过 表 达miR-29c 后，CCK8 及Transwell 实验结果显示A549 细胞增殖、迁移、侵袭能力下降，流式实验显示凋亡率升高，提示miR-29c在肺癌A549 细胞中低表达，miR-29c 可抑制肺癌A549 细胞增殖和迁移侵袭能力，促进其凋亡，在肺癌A549细胞中miR-29c起到抑癌基因的作用。

NASP 是一种组蛋白伴侣，存在于所有的分裂细胞中，并同时结合核心和连接蛋白［13］。已有研究发现，NASP 与肿瘤细胞的生长增殖密切相关［14-15］。有研究提出，NASP 在肾癌细胞中高表达，敲低tNASP 基因可有效抑制肾癌细胞增殖，并通过REK/MAPK 信号通路引起G1 期阻滞。YU 等［15］证实，在胃癌组织中沉默NASP 基因后，可抑制胃癌细胞增殖，升高凋亡率。另有研究提出，沉默tNASP可抑制前列腺癌细胞增殖，促进其凋亡［16］。本研究中，与正常肺上皮细胞HBE 相比，A549 细胞中NASP mRNA和蛋白表达均升高；在A549 细胞沉默靶基因NASP后，肺癌A549 细胞增殖、迁移、侵袭能力下降，凋亡率升高；过表达NASP后，A549细胞增殖、迁移、侵袭能力升高，凋亡率下降。与文献报道一致，说明NASP为肺癌的促癌基因。

本研究中，在A549 细胞中过表达miR-29c 后，NASP 蛋白表达水平下降。过表达NASP 可逆转过表达miR-29c 对A549 细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用和对其凋亡的促进作用。猜测NASP 和miR-29c 存在靶向作用关系。我们通过TargetScan 软件分析发现，NASP 是miR-29c 的潜在靶标，并且双荧光素酶实验证实了NASP 和miR-29c 的靶向关系。说明miR-29c 可能通过靶向抑制NASP 的表达从而抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。

综上所述，非小细胞肺癌细胞A549 中miR-29c表达降低、NASP 表达升高。 miR-29c 可抑制肺癌A549细胞增殖和迁移侵袭，并促进其凋亡，而NASP促进肺癌A549细胞的增殖和迁移侵袭，并抑制其凋亡，并且过表达NASP 可逆转miR-29c 对A549 细胞增殖和迁移、侵袭能力的抑制作用和对其凋亡的诱导作用。miR-29c 与NASP 存在靶向关系。但是，关于miR-29c 影响肺腺癌A549 细胞发生发展的具体机制尚不完全清楚，仍需要进一步的研究。