单糖组合对藤壶金星幼虫附着的影响研究

尤嘉杰 ，平双双 ，刘琪 ，靳翠丽 ，2，周晓见 ，2

（1.扬州大学环境科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏 扬州 225127）

海水中的人工设施表面常会发生大量海洋生物聚集生长的现象，被称为海洋生物污损（Marine Biofouling）[1]。海洋生物污损给海洋资源开发带来严重危害，影响网箱养殖的水体交换和营养竞争，还可能带来外来生物入侵，危害生态安全。全球每年由于生物污损造成的各类经济损失超过200 亿美元[2-3]。藤壶 Amphibalanus (Balanus) amphitrite 作为无脊椎污损动物的模式生物，和很多养殖经济无脊椎动物一样，幼体阶段营浮游生活，成体营底栖生活。藤壶浮游阶段包括六个无节幼体期和一个金星幼虫期，金星幼虫阶段不进食，其主要目的是寻找合适的附着点[4]。金星幼虫有一对触角，上有嗅觉和触觉化学感受器，能感知环境中合适的诱导附着信号[5]。幼虫的附着变态过程需要接受或感知外源信号，然后将外源信号转换成体内信号传递到特定的部位和组织，并启动附着、组织凋亡和增生，从而完成变态过程，最后固着生长在基质表面[6]。藤壶分布的群居格局就是通过金星幼虫期的附着变态过程实现的[7]。

藤壶A. amphitrite 产生的糖蛋白复合物（Settlement Inducing Protein Complex, SIPC）可以高效诱导同物种的幼虫附着，是指引其群居性的化学信号物质之一。SIPC 是一种糖蛋白，已经证明其碳水化合物部分与蛋白质部分在诱导金星幼虫变态过程中同样重要。SIPC 亚基中的糖链单元对藤壶的幼虫附着有重要作用[7-8]。另外。海水中物体表面覆盖着的生物膜由硅藻或细菌分泌的胞外多聚物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）形成基质，其 EPS 也会影响多种底栖无脊椎动物的幼体附着和变态[9-11]。藤壶触角上的感受器能够识别 EPS 中的糖链特征[5，10，12]。该文前期工作研究的底栖硅藻Stauroneis sp. 的EPS对藤壶金星幼虫附着也有良好的诱导作用[13]。所以，糖信号可能是指引藤壶金星幼虫附着的重要因素。

该文研究4 种单糖以及它们的不同浓度对藤壶金星幼虫附着的影响，通过分析比较，找出诱导活性最强的单糖种类和浓度，为藤壶幼虫附着的机理研究提供基础试验依据。

1 材料和方法

1.1 藤壶幼虫

藤壶（Amphibalanus amphitrite）成体采自连云港潮间带（北纬 34°88′，东经 119°19′），获得无节幼体后，采用Thiyagarajan 等人的方法，在24 ℃下用新鲜人工海水饲养无节幼体，喂饲纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis），培养5~6 d 后，得金星幼虫。生物测试之前，金星幼虫在4 ℃冰箱存放2 d[14]。

1.2 单糖影响金星幼虫附着的正交试验

4 种单糖 D-甘露糖（Man）、D-葡萄糖（Glc）、D-木糖（Xyl）和L-岩藻糖（Fuc）标准品均购自阿拉丁试剂公司。单糖选择的依据有：这些单糖在前期试验中对藤壶金星幼虫附着表现出较好的诱导活性，是藤壶SIPC 的优势单糖，是藤壶金星幼虫感受SIPC 的可能识别位点[15]。另外，这些单糖也是该实验室研究的底栖硅藻Stauroneis sp. EPS 的优势单糖，该硅藻EPS 对藤壶金星幼虫附着有良好的诱导作用[13]。

根据前期试验经验，单糖 Man、Glc、Xyl 的 3 个浓度分别为 5.00×10-8、1.25×10-8、0.31×10-8mol/L，Fuc 的 3 个浓度分别为 7.60×10-7、1.90×10-7、0.50×10-7mol/L。选择L9（34）正交表进行四因素三水平的正交试验，试验设置见表1，共有9 组试验，每组试验重复6 次，培养时间64 h。同时，另设置一组对照，对照组不添加单糖。

1.3 藤壶金星幼虫附着生物测试

24 孔板的每一个孔中加入1 mL 人工海水（盐度S=35），再加入20 μL 待测单糖的海水溶液，对照孔仅加20 μL 海水。每个样品6 个重复，每个孔加入金星幼虫15 个，24 ℃避光培养。在幼虫附着培养期间，在 12、20、28 和 64 h 分别记录每个孔中死亡、浮游和附着金星幼虫的数量，计算各时间点的附着率[14]。

1.4 数据分析

所有试验重复6 次，所获得的数据采用IBM SPSS 22 软件进行分析，绘图采用Excel 软件。

分析正交试验组别间的差异，选择单因素ANOVA 方差分析，利用最小显著差数法（LSD 法）进行多重比较。进行正交试验直观分析和方差分析，确定4 种单糖的影响力大小及差异统计学意义，选择一般线性模型（General Linear Model）/单因变量多因素方差分析（Univariate）/全模型（Full Factorial）分析单糖的主效应，确定有显著性影响的单糖的最适浓度。与对照组进行比较，分析藤壶金星幼虫的附着动力学，计算t10、t30、t50和t80（金星幼虫附着率分别达到10%、30%、50%和80%时的附着时间）[16]，选择回归/Probit 计算 t10、t30、t50和 t80。各分析指标差异统计学意义以P=0.050 或0.010 作为标准[17]。

2 结果

2.1 正交试验不同组别的藤壶金星幼虫附着情况

在不同单糖种类和浓度组合的9 组正交试验处理中，藤壶金星幼虫都能附着，但在不同的附着时间点，各组幼虫附着率有明显差异（图1）。

图1 正交试验不同组别藤壶金星幼虫附着情况

在附着时间为12 h 时，除了第8 和第9 组外，金星幼虫均有附着，其中第2、3 两组附着率最高，分别达到45.5%和40.2%，极显著高于其他各组（P<0.01）。附着时间为20 h 时，附着率最高的仍是第2组，达到68.9%，其次是第1 和第3 组，分别达到45.9%和55.5%，极显著高于其他各组（P<0.01），其它各组藤壶金星幼虫也均有附着，附着率最低的是第8 组，只有5.8%。在28h 时，附着率最高的分别是第2、3 组和第1 组，附着率依次达到72.1%、63.9%和54.8%，极显著高于其他各组（P<0.01），附着率最低组仍然是第8 组，只有8.1%。在附着时间为64 h时，第8 组仍然是附着率最低的，只有42.0%，其次是第4 组，为47.9%，极显著低于其他各组（P<0.01）。最终，第 1、2、3、6 和第 9 组金星幼虫附着率均高于70%，最高为第2 组，达到84.0%。第2 组从12 h 到64 h 的附着时间内，附着率始终保持最高，而第8组则始终处于9 组中附着率最低的状态。因此，4 种单糖形成的9 个组合中，最有利于藤壶金星幼虫附着的是第 2 组，即 Man（5.00×10-8mol/L）、Glc（1.25×10-8mol/L）、Xyl（1.25×10-8mol/L）和Fuc（1.90×10-7mol/L）的组合诱导金星幼虫附着的效果最好。

2.2 4 种单糖对藤壶金星幼虫附着的影响

对正交试验所得到的试验结果进行直观分析，综合4 个附着时间点的效果来看，4 种单糖对藤壶金星幼虫附着的影响是不同的，影响力由大到小依次为：Man＞Fuc＞Glc＞Xyl。再对正交试验的 4 种单糖进行方差分析，以进一步确定4 种单糖对藤壶金星幼虫的影响是否具有统计学意义，结果见表2。

4 种单糖中，Man 对4 个时间点的藤壶幼虫附着率均有极显著影响（P<0.01）。Fuc 在3 个时间点的影响是显著的，其中在12 h 和20 h 对藤壶幼虫附着有显著影响（P<0.05），在64 h 有极显著影响（P<0.01）。Glc 在2 个时间点对藤壶幼虫附着的影响是显著的，在12 h 有显著性影响（P<0.05），在64 h有极显著影响（P<0.01）。而Xyl 对4 个时间点藤壶幼虫附着的影响都不显著（P>0.05）。因此结合直观分析和方差分析的结果可以得到的结论是：4 种单糖中Man 对藤壶金星幼虫附着影响最大且效果是极显著的，其次影响很大的是Fuc，效果显著，第三位的单糖是Glc，在一些时间点显示出显著的效果，单糖Xyl 对藤壶金星幼虫的附着没有显著性影响。

表2 4 种单糖对藤壶金星幼虫附着诱导活性的主效应分析（n=6）

附着时间 变异来源 Man Glc Xyl Fuc 误差 总数SS 21 081.6 1 328.0 131.8 2 757.9 16 448.2 41 747.5自由度 2 2 2 2 45 53 20 h MS 10 540.8 664.0 65.9 1 378.9 365.5 F 28.8 1.8 0.2 3.8 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 28 h SS 19 101.8 1 369.7 901.1 1 749.4 19 225.6 42 347.6自由度 2 2 2 2 45 53 MS 9 550.9 684.9 450.6 874.7 427.2 F 22.4 1.6 1.1 2.0 P<0.01 >0.05 >0.05 >0.05 64 h SS 4 878.3 2 381.8 43.8 3 954.2 8 534.1 19 792.2自由度 2 2 2 2 45 53 MS 2 439.2 1 190.9 21.9 1 977.1 189.6 F 12.9 6.3 0.1 10.4 P<0.01 <0.01 >0.05 <0.01

为了确定正交试验中3 种有显著性影响的单糖的浓度效应，将单糖Man、Fuc 和Glc 按照浓度梯度水平和该水平幼虫附着率均值作图[17]。结果如图2 所示，当Man 单糖浓度从5.00×10-8mol/L降到0.31×10-8mol/L，金星幼虫附着率持续下降，呈现出Man 单糖浓度越高，幼虫附着率越高的规律，因此Man 诱导金星幼虫附着活性最强的浓度为 5.00×10-8mol/L（图 2a）。Fuc 单糖浓度从 7.60×10-7mol/L 降到1.90×10-7mol/L，幼虫附着率有所上升，再降至0.50×10-7mol/L 时，附着率则普遍下降，说明Fuc 在1.90×10-7mol/L 浓度时诱导金星幼虫附着的活性最强（图2b）。Glc 浓度从5.00×10-8mol/L 降到1.25×10-8mol/L，幼虫附着率除了在64 h 时间点基本持平外，在其他时间点的幼虫附着率略有上升，单糖浓度继续降低至0.31×10-8mol/L，12 h 幼虫附着率基本持平，其他时间点的幼虫附着率持续上升，所以对Glc 而言，诱导幼虫附着活性最强的浓度是0.31×10-8mol/L（图2c）。因此设计诱导藤壶金星幼虫附着的单糖组合时应优先考虑Man，且应选取最高浓度，Fuc 和Glc分别选取中间浓度和最低浓度，Xyl 的浓度则选取最低浓度即可。

图2 藤壶金星幼虫在三种单糖浓度下的附着率

2.3 藤壶金星幼虫附着的动力学分析

将添加单糖的9 个正交试验组和无单糖添加的对照组进行比较，分析藤壶金星幼虫的附着动力学，计算各组的 t10、t30、t50和 t80[16]。结果如表 3 所示，从各附着时间数值看，除了第 1、2、3 组外，其余各组的数值均大于对照组，这意味着达到相同的幼虫附着率比对照组需要的附着时间更长。在第 1、2、3 组中，t10、t30、t50和 t80最小的始终都是第 2组，也就是说第2 组金星幼虫实现10%、30%、50%和80%附着率所需要的附着时间最短，只需3 h就能够迅速实现10%的幼虫附着，而对照组实现10%附着率需要8.4 h。第2 组快速启动附着的优势不断积累，造成t50只需14.5 h，比对照组短9 h，t80保持了用时短的优势，仍比对照组少5.5 h。因此，添加的单糖组合能加速金星幼虫附着，使幼虫附着的时间进程缩短。

表3 藤壶金星幼虫附着的时间进程特征

3 讨论

藤壶无节幼体变态成金星幼虫后，不再摄食，此时幼虫的主要职责就是寻找到合适的附着地点，成功变态完成种群的延续。金星幼虫寻找附着地点时，需要化学信号的指引，这些信号包括SIPC 和环境中其他的水溶性信号分子。海洋生境中到处存在生物膜，能够提供诱导藤壶等大型无脊椎污损生物幼虫附着变态的信号。生物膜EPS 中的多糖成分，对于大型污损生物幼虫的附着具有指引或者诱导作用，受到了普遍关注并不断得到证实[9，18-20]。用凝集素LCA 特异性屏蔽SIPC 糖链结构中的特定单糖，发现SIPC 诱导幼虫附着的活性丧失。凝集素LCA能特异性地和Glc、Man 结合，所以，糖链上的Glc和Man 可能是藤壶幼虫感受SIPC 附着信号的识别位点[7-8]。而且Man 是SIPC 糖链的优势单糖，在糖链上形成2~9 单体的聚合单元，另外糖链上还含有少量单个Fuc 和少数Man 单体形成的低聚单元[15]。因此有理由推测，单糖Man、Glc 和Fuc 可能与金星幼虫对附着信号的识别有关。该研究的结果证实，单糖 Man、Glc、Xyl 和 Fuc 的组合对藤壶金星幼虫的附着具有强烈的诱导效果。在这个组合中，4 种单糖的重要性有所不同。Man 单糖与藤壶金星幼虫的附着密切相关，是4 种单糖中诱导附着活性最强的一种。4 种单糖中，只有Xyl 是五碳糖，Man 和Glc 都是六碳糖，比Xyl 具有更多的羟基，与金星幼虫触角的极性基团结合更紧密，可能因此导致诱导幼虫附着的活性更强[19]。Man 具有强烈的诱导金星幼虫附着的活性，最适浓度为5.00×10-8mol/L；Glc也能诱导幼虫附着，最适浓度是0.31×10-8mol/L；Fuc 诱导金星幼虫附着的活性很强，最适浓度是1.90×10-7mol/L，比 Man 和 Glc 的浓度略高；Xyl 在0.31×10-8mol/L 到 5.00×10-8mol/L 浓度之间没有表现出明显的诱导活性，这说明诱导活性除了和羟基数量有关以外，可能还与单糖浓度有关。大多数细胞外信号分子在非常低的浓度下起作用（通常为10-8mol/L），但识别它们的受体亲和力不同，可能导致Xyl 需要更高的浓度[5]。因此，单糖的种类和浓度共同决定了金星幼虫的附着情况。

该研究不仅考察藤壶金星幼虫最终的附着率，还关注了幼虫附着的时间进程，设置了不同的时间点观察幼虫的附着情况，并分析了藤壶金星幼虫的附着动力学，对实现各附着率所需要的时间进行比较。结果发现添加合适浓度的单糖能极大地缩短藤壶金星幼虫的附着时间，尤其是在幼虫附着的早期阶段，使幼虫启动附着的时间提前，单糖添加最优组达到10%金星幼虫附着率的时间比没有添加单糖的对照组提前了5.5 h，达到50%附着率的时间也缩短了9.0 h。这意味着添加合适种类和浓度的单糖，为金星幼虫提供了适宜的附着信号，大大减少了幼虫寻找和探索附着地点的时间。研究双壳贝类白樱蛤Macoma balthica 的面盘幼虫在硅藻生物膜上的附着试验结果表明，幼虫的附着率和穴居率不仅与生物膜中的生物量和EPS 浓度密切相关，而且流水中的幼虫附着率明显低于静水试验，说明幼虫快速附着对其成功繁衍的重要性[21]。在藤壶和养殖经济无脊椎动物的实际生境中，缩短幼虫的附着进程，尽早找到合适的附着地点并启动附着程序，对于降低幼虫病死率、提高种群繁衍成功率具有重要意义。