海水网箱养殖许氏平鲉细菌性疾病病原鉴定及致病性研究

李赟，许岩，陈文博，张赛赛，孙阳，丁勇

（大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023）

许氏平鲉（Sebastes schlegeli）隶属于鲉形目（Scorpaeniformes）、鲉科（Scorpaenidae）、平鲉属（Sebastes），别名“黑头”“黑石鲈”“黑鲪”，我国主要分布地区为黄渤海一带。由于其具有耐寒能力强、生长速度快、肉质肥美等优点，成为北方海水网箱养殖中主要鱼类之一[1-2]。大李家海域周边是大连市大型海水网箱养殖的集中地之一，养殖的主要品种有红鳍东方鲀、许氏平鲉等。近年来，随着海水网箱养殖经济效益的上升，该区域网箱养殖规模不断扩大，疾病的发生也越来越频繁，成为影响养殖成活率的关键因素。

此次许氏平鲉大规模染病现象于2019 年8 月出现在大李家街道近海海水网箱中，造成大多数许氏平鲉死亡。病鱼的主要症状表现为：游动不规律，体表出现明显创伤性溃疡，鳍条溃烂，严重个体下颚溃烂，身体不能保持平衡等。经过现场取样后，在患病的鱼体内脏中分离出优势菌株，并验证该菌株的感染能力，从生化特性、形态特征等多个方面切入，确定了分离出的菌株为哈维氏弧菌，它同时也是其他诸多海水鱼类流行性疾病的感染源之一[3-5]，笔者将分离得到的哈维氏弧菌进行药物敏感性试验，以期为许氏平鲉的健康养殖提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病许氏平鲉取自大连金石滩海域养殖个体户，8 月中旬发病，发病鱼体长15～25 cm，体表及鳍已明显出血，尾部和下颚溃烂。100 尾健康许氏平鲉来自大连天正实业有限公司养殖基地，暂养于75 L水族箱，采用充气泵增氧，体质量（25±2）g，体长（10±2）cm，每天进行 1 次吸污，2 次投饵，暂养过程中养殖海水盐度严格控制在32‰，水温控制在24 ℃。药敏纸片、弧菌科细菌生化鉴定管以及TCBS、TSB、2216 E 培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌分离

为排除寄生虫和真菌感染，选择典型的体表溃烂的许氏平鲉，在显微镜下观察刮取到的溃烂处组织以及鳃和体表粘液。将病鱼的尾部用酒精棉球擦拭，使用2.5 mL 无菌注射器采用静脉取血的方式在尾部取血液0.5 mL，然后将血液涂布在平板上；用接种环划取体表溃烂处，划线接种于2216 E 平板；在无菌环境下取病鱼的肾、脾、肝等组织，经磷酸盐缓冲液研磨后，将研磨液同样划线接种于2216 E平板，培养温度设置在28 ℃，孵育24 h。最后从菌群中选出形态一致的优势菌落，对其纯化培养三次得到纯菌株，在-80 ℃下用TSB 冻存液（含15%甘油的TSB 培养基）保存。

1.3 人工感染试验

选取70 尾健康鱼用于回感试验，试验鱼饲养于45 L 玻璃缸中，分成 7 组，每组10 尾，组别分配为空白组1 组、对照组1 组、试验组5 组。试验组在TSB 培养基培养24 h 后，使用无菌PBS 洗涤三次，使用0.85%NaCl 溶液调整菌悬液的密度至3×107CFU/mL[6]。用生理盐水对该菌悬液进行梯度稀释后分别制成浓度为 3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL 的菌液。感染试验采用腹腔注射方式进行，试验组每尾注射0.1 mL 菌液，对照组注射等量无菌PBS，空白组不注射。处理后每天对许氏平鲉的死亡和发病状况进行观察，并按照正常饲养条件进行吸污和换水，将观察到的结果记录下来，同时取出具有自然患病症状的人工感染发病许氏平鲉，再次对细菌进行分离和纯化。

1.4 病原形态与生理生化鉴定结果

采用划线接种，在TCBS 和2216 E 平板上接种纯化细菌，并在28 ℃下培养，孵育24 h 后，从理化特性和形态学等水平测定分离菌株的相应指标。依据文献[7-8]的方法对理化特性进行测定，即采用革兰氏染色法对供试菌进行涂片、染色，然后镜检供试菌的形态。

1.5 分子生物学鉴定

模板DNA 的制备：将待测细菌单菌落（纯培养）置于50 μL 无菌去离子水中，沸水煮5 min，放置在冰上冷却后瞬间离心，取上清液用作PCR 扩增。使用文献[9]中的方法进行16 S rRNA 基因序列的PCR 扩增与测序，扩增产物送至天津华大基因科技有限公司进行测序。使用NCBI 的Blast 检索系统确定16 S rRNA 基因序列的同源基因。通过以上方法确定了同源性较高的菌株，使用Clustalx 软件将其与所得菌株16 S rRNA 基因的序列比对后构建系统发育树，并进行置信度检测，检测1 000 次。

1.6 药物敏感试验

根据美国NCCLS 试验标准方法[10]，测定14 种抗生素对于分离菌株是否有效，使用K-B 法测定分离菌株的敏感性。使用28 ℃培养箱培养营养肉汤中的菌株，并将菌液的浓度调整到3.0×107CFU/mL，培养24 h。在MH 琼脂上均匀涂布150 μL 菌液，使用各种药敏纸片，在28 ℃下孵育24 h，测量抑菌圈直径大小，对照药敏纸片说明确定该菌株对于各种抗菌素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病鱼检查

患病鱼体表溃疡，鳍条略有溃烂。解剖病鱼发现肠有少量积水，颜色较浅。在对病灶、鳃以及粘液等组织镜检后，并未发现真菌和寄生虫；病灶、肾、肝、肠在透射电镜下未见病毒粒子。

图1 患病许氏平鲉体表溃疡

2.2 致病性验证

感染试验共进行10 d，以注射结束后24 h 计为1 d。如图 2 所示，3×107CFU/mL、3×106CFU/mL、3×105CFU/mL 试验组的许氏平鲉均在注射菌液2 d后出现死亡。其中，3×107CFU/mL 组在第4 天全部死亡，3×106CFU/mL 组在第 5 天全部死亡，3×105CFU/mL组在第7 天全部死亡。注射菌液浓度为3×104CFU/mL的试验组，培养4 d 后开始发现死亡，至试验结束，累计70%死亡；菌液浓度为3×103CFU/mL 病死率为30%。从生理活动来看，人工感染后的许氏平鲉游动迟缓、摄食量减少，死亡鱼的体表存在出血点和溃疡，部分还会出现腹水，与自然感染无异。相比之下，空白组和对照组均无死亡和异常。采用划线接种的方法在TCBS 平板上接种人工感染后发病的濒死鱼腹水及内脏分离菌株，通过形态和理化特性分析，新分离株和原感染菌株基本一致。利用李长红等[11]改良的寇氏法，可以得到菌株BN-1910 对许氏平鲉 10 d 的 LD50 为 7.98×103CFU/mL。

图2 人工感染试验结果

2.3 病原菌的形态观察

在患病许氏平鲉的病灶中分离出一株优势菌株，命名为BN-1910。对此菌株分离纯化，并在28 ℃下使用TSB 琼脂平板培养，观察培养18~24 h 后的菌落形态，如图3 所示，可以发现其直径多在2 mm 左右，从中央略隆起，表面光滑，呈半透明圆形。该菌株能够在TCBS 培养基上生长，菌落呈短棒状，表现为黄色、隆起、边缘整齐、圆形光滑，革兰氏染色阴性。

2.4 病原菌理化特征

理化特性见表1。

图3 菌株在TCBS 平板上的菌落形态

表1 生化反应结果

注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性；“F”表示发酵；“d”表示结果为阳性或阴性均有。

2.5 16S rRNA 基因序列分析及系统发育树构建

使用PCR 扩增所分离菌株BN-1910 的16S rRNA基因序列，测序后获得1 449 bp 的DNA 片段。将测序所得序列提交至NCBI 进行BLAST 分析，以16S rRNA基因构建的系统发育树显示，菌株BN-1910 与哈维氏弧菌聚为一支，置信度99%（图4）。由以上结果出发，可以判断菌株为哈维氏弧菌。16S rRNA 基因序列与MT864681.1 比对情况如图5 所示。

图4 菌株BN-1910 的系统发育树分析

图5 16S rRNA 基因序列与MT864681.1 部分比对结果

2.6 药敏特性

抗生素敏感性测试的结果如表2 所示。由表可知，分离菌株对左氧氟沙星、链霉素和氟哌酸高度敏感，对氟罗沙星、庆大霉素和卡那霉素中度敏感，对另外八种抗生素不敏感。

表2 药敏试验结果

3 讨论

海水鱼类网箱养殖成为捕捞渔民转产转业、渔业结构调整的优先发展产业。许氏平鲉是大连海域常见鱼类，本地海洋牧场重点增殖鱼类，也是大连市增殖放流品种之一，它已成为我市重要的海水网箱养殖鱼类。近几年，大连市许氏平鲉养殖规模逐渐扩大，集约化程度不断提高，但疾病防控水平受限，同时投喂冰鲜饵料存在潜在细菌污染[12]，许氏平鲉发病时有发生[13]，给养殖企业造成了一定的经济损失，阻碍了网箱养殖产业健康发展。

目前日本、韩国许氏平鲉养殖有较多关于细菌性疾病报道，说明细菌性疾病是影响许氏平鲉网箱养殖的关键因素。这些报道中涉及的弧菌包括奥氏弧菌（V.ordalii）、创伤弧菌（V.vulnf icus）、溶藻胶弧菌（V.alginolyticus）、鳗弧菌（V.anguillarum）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（V.harveyi）等[14]。许氏平鲉受弧菌感染后主要表现有体色发黑、表皮充血红肿，游动不规则，摄食差，严重时肌肉腐烂，此次金州区患病鱼发病特征与弧菌病十分相似。本研究通过分离病鱼病灶获得优势菌，并利用感染试验证明其对于许氏平鲉的致病力。从生理生化、形态特征和16S rDNA 基因序列比对后确定了该菌株为哈维氏弧菌。有报道表明哈维氏弧菌能感染大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[15]暴发溃疡病，病鱼出现体表出血、肌肉溃烂、眼球凸出症状，部分特征与本研究病鱼高度相似。受哈维氏弧菌感染的黑鲷（Sparus macrocephalus）[16]、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）[4]也出现类似患病特征。哈维氏弧菌相关研究发现其胞外产物有多种活性酶类物质，其中分子量约38 kDa 的蛋白酶对鲫（Carassius auratus）有致死毒性[17]。

药敏试验表明分离菌株对左氧氟沙星、链霉素和氟哌酸高度敏感，对氟罗沙星、庆大霉素和卡那霉素中度敏感。药敏试验结果对哈维氏弧菌的防治有参考价值，患病初期的鱼体可尝试选用氟哌酸、链霉素和左氧氟沙星药浴进行防治。疾病的预防最为主要，黄辉等[18]研究显示重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU 具有良好的免疫原性, 可作为亚单位疫苗的开发对象。