2种中药复方联合植物乳杆菌对抗生素相关性腹泻的缓解作用

郭 新，闫子鹏，李光辉，孟锦鑫，韩艳君，孙子龙

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801）

抗生素已经被广泛应用于人和动物各种疾病的预防和治疗中，对畜牧业的发展也起到了一定的促进作用。然而，滥用或过量使用抗生素将会导致抗生素耐药性、细菌易感性和反复感染的风险增加，威胁人体健康和生态环境安全[1]。抗生素相关性腹泻是大多数抗生素长期应用的常见并发症，特别是广谱抗生素，如克林霉素、β-内酰胺类和第三代头孢菌素[2-3]。腹泻经常发生在猪、羊等养殖场，发病速度快、病程短，必须及时进行诊断和治疗，否则将会导致动物大量死亡，给养殖业造成巨大的经济损失[4]。

中药因其具有安全、高效、低毒、不易产生耐药性等优点，在动物疫病防控中发挥着越来越大的作用[5]。微生物发酵是中药材的重要炮制手段之一，运用发酵的手段对中药材进行处理，借助微生物与酶的作用，在一定的环境下，通过发酵可以改变其原有的性能，增强或产生新的功效，扩大治疗范围[6-8]。同时，发酵中药还可以节省药材资源，保护环境，增加中药制剂的安全性以及质量控制[9]。

近年来，有很多研究显示乳酸菌（Lactobacillus）在畜牧生产中以及中药发酵中起着重要的作用，对动物机体的保健以及疾病的治疗都有很好的效果。如在青贮饲料的发酵过程中添加乳酸菌，不仅可以有效地抑制有害菌的繁殖，而且也改善了饲料的发酵品质[10]。乳酸菌发酵黄芪多糖制剂应用在肉鸡养殖上，可以提高肉鸡的生长性能、改善肉鸡肠道的微生物体系[11]。

本研究通过植物乳杆菌发酵补中益气汤和参苓白术汤，对小鼠稀便率、肠道形态、肠屏障功能相关基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 的表达进行检测，旨在通过利用中药、益生菌或发酵中药减轻由抗生素引起的腹泻的研究提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 无特定病原体（SPF）级体质量大小一致、健康的雄性ICR 小鼠（3 周龄）189 只，购自山西医科大学试验动物中心。

1.1.2 药物和试剂 补中益气汤（BZYQ）是由炙黄芪、党参、炒白术、炙甘草、当归、陈皮、升麻、柴胡8 味中药组成；参苓白术汤（SLBZ）是由党参、茯苓、炒白术、山药、炙甘草、炒白扁豆、莲子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗、陈皮11 味中药组成，药材购自北京同仁堂药店；头孢曲松钠购自北京索莱宝生物科技有限公司，植物乳杆菌CICC 21809 购自中国食品发酵工业研究院有限公司；Trizol、PrimeScriptTM试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMII 试剂盒均购自大连Takara公司；苏木精-伊红染色试剂盒、无水乙醇、二甲苯、中性树脂均自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 生化培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、生物组织包埋机（金华惠友仪器设备有限公司）、生物组织切片机（德国Leica 仪器设备有限公司）、生物组织摊烤片机（孝感市亚光医用电子技术有限公司）、生物显微镜（日本Olympus 公司）、高精度移液枪（德国Eppendorf 公司）、超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）、ND-2000 核酸蛋白测定仪（美国NanoDrop 公司）、Mx3000P 实时荧光定量PCR 仪（美国Stratagene 公司）。

1.1.4 中药、菌液与发酵中药 按照《中华人民共和国兽药典》[12]中的比例称取1.1.2 中药材，加蒸馏水浸泡1 h，煎煮2 次，每次45 min，过滤去渣，合并浓缩药液为1 g/mL；使用食品级碳酸钠将pH 值调至6.5，即制得补中益气汤和参苓白术汤。将植物乳杆菌菌株接种到已灭菌的乳酸细菌液体培养基（MRS）中，在37 ℃下培养24 h，制得益生菌液（LP），并将其以3%的接种量分别接种到补中益气汤和参苓白术汤中，在37 ℃下发酵24 h，以达到107cfu/mL。即制得补中益气汤发酵液（FBZYQ）和参苓白术汤发酵液（FSLBZ）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及给药 适应性饲养7 d 后，小鼠随机分成7 组，每组8 只，重复3 次。在空白对照组（BC）中，每天分别在9：00 和13：00 给小鼠灌胃0.3 mL 生理盐水2 次；在头孢曲松钠组（CS，4 g/（kg·d））中，分别在9：00 和13：00 灌胃给小鼠0.3 mL 头孢曲松钠溶液和0.3 mL 生理盐水；对于头孢曲松钠＋益生菌组（CS＋LP）、头孢曲松钠＋补中益气汤组（CS＋BZYQ）、头孢曲松钠＋参苓白术汤组（CS＋SLBZ）、头孢曲松钠＋补中益气汤发酵液组（CS＋FBZYQ）和头孢曲松钠＋参苓白术汤发酵液组（CS＋FSLBZ），分别于9：00 和13：00 通过灌胃给予小鼠0.3 mL 头孢曲松钠溶液和相应的0.3 mL 药液。各组小鼠单独分笼饲养，连续处理治疗7 d，试验期间各组饲养管理条件完全一致。在第1、4、7 d，分别记录小鼠精神状态和排便情况，在第8 天，对小鼠实施安乐死，将肠组织储存在-80 ℃条件下，后续进行qRT-PCR。每组3 个样品固定在4%多聚甲醛溶液中进行肠道组织病理学观察。

1.2.2 稀便率测定 在13：00 灌胃2 h 内，分别统计每只小鼠的稀便数和总便数。稀便率为2 h 内每只小鼠所排稀便数与总便数的比值。

1.2.3 石蜡切片的制作及苏木精-伊红（HE）染色

将固定好的组织沿横截面切成1 cm 左右的管状，进行脱水、透明、浸蜡和包埋，使用切片机切成5 μm 厚的切片，摊片，烤片，之后用于HE 染色。

将制得的切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后；苏木精染色，分化液分化，自来水冲洗蓝化；再进行梯度酒精脱水；然后伊红染色；高浓度酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片，制得HE 染色切片。晾干后在显微镜下观察各组小鼠十二指肠、空肠和回肠组织情况，并拍照保存。

1.2.4 十二指肠和结肠基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 相对表达量测定

1.2.4.1 引物设计与合成 由Primer 3.0 plus 设计的内参基因和目的基因的序列为GAPDH、AQP8和Claudin-1（表1），引物均由生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4.2 RNA 提取和qRT-PCR 将0.5～1.0 cm 的十二指肠和结肠组织剪碎，将其加到1 mL 的Trizol中进行RNA 提取。RNA 的质量用核酸蛋白浓度测定仪（ND-2000）鉴定；然后使用PrimeScriptTM试剂盒反转录得到cDNA，使用SYBRRPremix Ex TaqTMII试剂盒进行qRT-PCR 扩增。反应条件为预变性95 ℃30 s；PCR 反应95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s；溶解曲线分析95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，并重复40 个周期。

1.3 数据分析

数据采用Graph Pad Prism 5.0 软件进行统计学分析，结果均用平均数±标准差来表示。稀便率和基因相对表达水平采用方差分析（ANOVA），用Tukey's进行检验（P＜0.05 为差异显著）。将GAPDH 作为内参，通过2-ΔΔCt法得出目的基因AQP8 和Claudin-1 的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 小鼠精神状态观察

试验前，小鼠活泼好动，粪便正常；造模后，小鼠表现腹泻、稀便、精神萎靡，毛色光泽度较差；而治疗后上述症状有所缓解。

2.2 不同处理组小鼠稀便率的变化

从图1 可以看出，与对照组相比，在第1、4、7 天头孢曲松钠组的小鼠稀便率均显著上升（P＜0.05），表明模型成功建立。其中，第1 天，除益生菌组外，其他给药组小鼠的稀便率与头孢曲松钠组相比均无显著性差异（P＞0.05）；第4 天，除参苓白术汤组外，其他给药小鼠的稀便率与头孢曲松钠组相比均显著下降（P＜0.05）；第7 天，与头孢曲松钠组相比，发酵组小鼠稀便率显著性下降（P＜0.05），且补中益气汤发酵液组和参苓白术汤发酵液组的稀便率从第4～7 天持续显著下降（P＜0.05）。

2.3 不同处理组小鼠小肠的形态学观察结果

各组小鼠小肠形态如图2、3、4 所示，可以观察到对照组小鼠的十二指肠、空肠和回肠3 种小肠绒毛结构正常，绒毛与隐窝界限分明，基本完好，无明显的病理变化（图2-A、3-A、4-A）；而头孢曲松钠处理引起小鼠的十二指肠、空肠和回肠的肠黏膜损伤，表现出短而宽的绒毛，深的隐窝，不完整和断裂、脱落的结构等病理变化（图2-B、3-B、4-B）；其他各个给药组均有不同程度的缓解效果，排列较为整齐紧密，结构相对完整。且发酵组的绒毛较长，缓解效果最好。

2.4 不同处理组小鼠十二指肠和结肠的基因表达量分析

各组小鼠的水通道蛋白AQP8 和紧密连接蛋白Claudin-1 在十二指肠和结肠中的mRNA 相对表达水平如图5、6 所示，在十二指肠中，与对照组相比，头孢曲松钠组的AQP8 mRNA 的相对表达量显著下降（P＜0.05）；与头孢曲松钠组相比，除参苓白术汤组，其他给药组的AQP8 mRNA 相对表达量均显著上升（P＜0.05）；相比头孢曲松钠组，补中益气汤发酵液组的Claudin-1 mRNA 的相对表达量显著升高（P＜0.05），其他处理组之间无显著性差异（P＞0.05）。在结肠中，与对照组和益生菌组相比，头孢曲松钠组的AQP8 mRNA 的相对表达量显著下降（P＜0.05），尽管其他给药组都有上升趋势，但差异均不显著（P＞0.05）；同时Claudin-1 mRNA 的相对表达量各处理组间无显著性差异（P＞0.05）。

3 结论与讨论

为了观察中药、益生菌和发酵中药对抗生素相关性腹泻的缓解作用，本研究通过灌胃头孢曲松钠成功建立了小鼠腹泻模型，它是广谱的第三代头孢菌素，广泛用于治疗胃肠道感染，但是重复使用会破坏肠道菌群的平衡，并引起腹泻等副作用[12]。

越来越多的证据表明，益生菌可以有效地恢复和平衡肠道菌群，预防和治疗抗生素引起的腹泻[13]。郭元晟等[14]研究结果表明，乳酸杆菌可以促进肉鸡小肠绒毛的生长发育，改善小肠的黏膜结构。还有一些研究发现，脾胃虚弱类型的比例在抗生素相关性腹泻患者中最大，因此，在临床药物和日常饮食中，补气、益气类中药被用于治疗肠道疾病、增强免疫力、缓解疲劳和延长寿命等[15]。补中益气汤、参苓白术汤作为经典的健脾益气、涩肠止泻方剂，经常被用来治疗脾胃虚弱、腹泻等[16-17]。在本研究中，用中药、益生菌和发酵中药连续治疗7 d 后，腹泻小鼠稀便率显著下降，其中，补中益气汤发酵液和参苓白术汤发酵液有持续缓解腹泻效果，表明发酵具有一定的优势。

肠道是重要的内脏器官之一，不仅可以消化和吸收营养，还可以保护人体免受病原微生物的侵害。在本研究中，通过HE 染色观察发现，头孢曲松钠组小鼠小肠绒毛受损，短而宽，出现不完整和断裂、脱落的结构，表明小肠的吸收功能和屏障功能受到严重损害[18]。小鼠腹泻后，肠道中的水分增加，粪便软化，在一定程度上刺激肠道黏膜，从而引起黏膜损伤。研究表明，中药在治疗肠黏膜屏障功能障碍中具有明显的优势[19]。小鼠灌服中药、益生菌和发酵中药后，肠绒毛损伤较轻，说明它们能够减轻腹泻对肠黏膜的刺激，对肠绒毛的完整性起到一定的保护作用。

肠上皮细胞通过紧密连接蛋白连接，从而调节肠道屏障通透性和上皮完整性。因此，紧密连接蛋白的稳态表达对于维持人类和动物健康至关重要[20]，其中，Claudin-1 是紧密连接结构中最关键的组成部分之一[21]。水通道蛋白（AQP）主要在胃肠道中表达，并且在一些生理和病理过程中发挥重要作用[22]，且远端小肠和近端结肠是AQP8 表达的主要部位[23]。张文娣等[24]观察显示，与抗生素相关的腹泻大鼠表现出胃肠道完整性下降和上皮组织不良，与对照组相比，水通道蛋白编码基因、紧密连接蛋白异常表达和杯状细胞数量减少。同样地，本试验研究发现，腹泻小鼠的十二指肠和结肠中的AQP8 mRNA 表达水平显著降低。在给予益生菌、补中益气汤和补中益气汤发酵液和参苓白术汤发酵液的小鼠中，AQP8 mRNA 表达水平得到了增强，十二指肠效果更明显。Claudin-1 mRNA 表达水平在补中益气汤发酵液中显著上升。这些结果大致与观察到的肠道形态结果一致，表明中药、益生菌和发酵中药在分子水平上显示出有益的特性。

本研究结果表明，头孢曲松钠引起了腹泻，导致了短而宽的绒毛以及肠结构的不完整和破裂，并且与肠屏障功能相关基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 表达下降。但是，中药、益生菌和发酵中药均不同程度缓解了头孢曲松钠引起的变化，特别是发酵中药显示出更持久的缓解作用。研究结果为中药、益生菌和发酵中药在抗生素临床使用上的进一步开发和应用提供了试验依据和理论基础。