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基于Sema3A/NRP-1/PlexinA体系探讨温阳通络方拮抗类风湿关节炎嗜神经侵袭的机制*

2021-02-23吴晶金李玲玉栗荣殷世云

中医学报 2021年2期
关键词:温阳通货号甲氨蝶呤

吴晶金,李玲玉,栗荣,殷世云

云南省中医医院,云南昆明650021

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。我国大陆地区的RA患病率约为0.2%~0.4%。其主要结局是残疾,在类风湿关节炎自然病程中,5~10年的致残率为60%,病程30年的致残率为90%,寿命缩短10~15年,而伴关节外表现者的5年生存率仅为50%[1],极大影响了患病人群的生活质量。开展干预RA研究对于人类健康具有重要意义。成纤维样滑膜细胞类似肿瘤样生长被认为是RA发生发展的重要机制,临床抗肿瘤药物如甲氨蝶呤、环磷酰胺等亦可用于类风湿关节炎的治疗。因此,从肿瘤发病学角度研究RA,有望发现全新的治疗靶标。基于嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)在肿瘤浸润转移中的关键作用,PNI相关神经营养因子及其受体在RA滑膜组织中亦有表达,该研究已为少数国外学者所重视,由此推测NI可能参与了RA的病理过程。本研究拟从Sema3A/NRP-1/PlexinA体系探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物SPF级DBA/1雄性小鼠90只,8周龄,体质量(21±5)g,购自北京维通利华实验动物有限公司,动物许可证号SCXK(京):2016-0011,饲养于云南省中医医院中心实验室SPF级动物房,实验前适应性喂养1周,自由摄水摄食。动物房温度维持在22~24℃,湿度维持在65%~70%。

1.2 药品与试剂温阳通络方(主要由附片、桂枝、麻黄、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中药组成),由本院药学部提供;甲氨蝶呤片,通化茂祥制药有限公司生产(批号:H22022674)。牛Ⅱ型胶原(CⅡ),sigma公司;完全弗氏佐剂(CFA),美国BD公司;信号素(Sema3A)抗体(abcam,货号:ab23393);神经纤毛蛋白-1(NRP-1)抗体(abcam,货号:ab81321);神经丛素(PlexinA)抗体(abcam,货号:ab23391);β-actin抗体(abmart,货号:T40104);HRP标记通用型二抗(Goat来源,CST,货号:7074S);蛋白酶抑制剂(Roche,货号:11206893001);First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas K1622);SYBR Green master mix(KAPA KK4601);DMEM(H)基础培养基(Gibco,货号:12800-017);胎牛血清(Gibco,货号:10099-141);0.25%胰酶(Gibco,货号:1894145);凋亡检测试剂盒(东仁化学,货号:AD10)。

1.3 仪器掌上离心机(其林贝尔);HITACH低温离心机(CF-16RX);全波长分光光度计(上海UNICO);酶标仪(Thermo);凝胶成像仪(BIO-RAD);垂直电泳槽(BIO -RAD);湿式转膜槽(BIO-RAD);定量PCR仪(ABI StepOne);紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000);超声破碎仪(美国Sonnic VCX310);流式细胞分选仪(Partec GmbH CyFlow Space)。

2 方法

2.1 造模及给药按随机数字表法将DBA/1小鼠随机分为空白组,模型组,甲氨蝶呤组(10 mg·kg-1),温阳通络方低、中、高剂量(2.0 g·kg-1、4.0 g·kg-1、8.0 g·kg-1)组,每组5只。除空白组外,其余小鼠均造模。配制浓度为2 mg·mL-1的牛Ⅱ型胶原溶液,置于4℃冰箱过夜。冰浴下与CFA按1∶1比例充分混匀,制成乳剂。固定小鼠后于距鼠尾根部1 cm处注射,每只100μL。致炎第21天起每日给予相应的药物干预,模型组与空白组均给予生理盐水灌胃10 mL·kg-1。第48天末次灌胃后禁食水,第49天脱臼处死。滑膜组织备测。

2.2 滑膜组织的收集小鼠处死后,置于冰上操作,仰位固定,迅速离断四肢,用冷生理盐水冲洗干净后沿踝关节上方剪下整个关节囊,一部分常规脱钙包埋,切片备用,一部分新鲜冻存于超低温冰箱。

2.3 滑膜细胞(FLS)体外培养实验取7周龄雄性DBA/1小鼠10只,完全去除皮肤和其他软组织,无菌分离各组实验动物踝关节,操作中始终避免破损导致骨髓细胞释放,以汉克斯平衡盐溶液(HBSS)冲洗,70%乙醇清洗后将其放入盛有HBSS的100 mm组织培养板中,剪开关节间隙。加入含胶原酶IV(终浓度为1 mg·mL-1)的DMEM全培基,摇床中37℃恒温震荡消化1 h,涡旋释放滑膜细胞后将上清移入新的离心管,加入DMEM 全培基后1 100 r·min-1室温离心10 min,将沉淀重悬于全培基中,接种培养于37℃,5%CO2孵育箱。传代培养至第3代,骨髓衍生系完全去除后,第4至8代细胞可用于后续实验。将细胞分为空白组、脂多糖(lipoposaccharide,LPS)组、温阳通络方组、温阳通络方加LPS组,用流式细胞术检测滑各组膜细胞凋亡情况。

2.4 指标的检测

2.4.1 W estern Blot法检测滑膜组织每组随机选择3只小鼠的滑膜组织迅速称重,每100 mg样本加入8倍体积预冷的蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制剂,0.4 mM PMSF,1 mM Iodo,1μM Pepstatin A)匀浆30 min。提取液4℃下,离心半径8 cm,12 000 r·min-1离心30 min后取上清,BCA法蛋白定量;用PBS调至等体积,加5×SDS上样缓冲液,沸水浴5 min;SDS-PAGE凝胶电泳,每孔上样20μg。配制 5% 积层胶、10% 分离胶,胶厚0.75 mm,膜于转移液(含甲醇15%)中平衡10 min,80 V转膜120 min后将膜取出,放入含5%脱脂奶粉的TBST,室温封闭1 h。取出膜,对应一抗1∶1 000稀释,4℃过夜;TBST洗3次,每次5 min;荧光二抗1∶10 000稀释,室温结合1 h;分别用TBST和PBS各洗3次,每次10 min。使用ODYSSEY 红外双色激光成像系统对Sema3A、NRP-1、PlexinA的蛋白相对表达量进行分析。

2.4.2 RT-PCR法检测滑膜组织每组随机选择3只小鼠的滑膜组织于玻璃匀浆器中,滑膜细胞则直接加入Trizol,以离心柱法提取总RNA,进行实时定量RT-PCR实验,检测Sema3A、NRP-1、PlexinA基因表达水平。(在pubmed上查询对应物种的目的基因mRNA序列,以CDS序列设计引物。应用beacon designer 7.90设计Q-PCR引物,引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4.3 流式法检测滑膜细胞凋亡将滑膜细胞随机分为空白组、LPS组、温阳通络方组、温阳通络方加LPS组。每组设3个复孔,移除细胞培养基,PBS清洗细胞3次,0.25%胰酶消化收集细胞。PBS清洗收集好的细胞3次,离心半径8 cm,1 000 rmp·min-1离心3 min,收集细胞,用400μL结合缓冲液重悬细胞,每组每个复孔均匀分成4管。第1管为空白组(不加任何试剂)、第2管为FITC对照组(加入5μL的Annexin V-FITC)、第3管为PI对照组(加入5 μL的PI)、第4管双染组(加入5μL Annexin VFITC和5μL PI),室温避光孵育15 min。用PBS将每管液体量补至1 mL后,在流式细胞仪下检测细胞凋亡,以1~3管为组合对照,以双染组分析滑膜细胞凋亡情况。

2.5 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间数据比较采用方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 温阳通络方对小鼠滑膜组织PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表达的影响与空白组相比,模型组小鼠滑膜组织中PlexinA、Sema3A、NRP-1的表达量明显升高(P<0.05),与相关文章中趋势一致;与模型组相比,温阳通络方各剂量和甲氨蝶呤组可明显升高PlexinA的表达量(P<0.05);温阳通络方高剂量组和甲氨蝶呤组可明显升高Sema3A的表达量(P<0.05);温阳通络方高、中剂量组和甲氨蝶呤组可明显升高NRP-1的表达量(P<0.05)。见图1、表2。

图1 温阳通络方对小鼠滑膜PlexinA、Sema3A、NRP-1蛋白表达水平的影响

表2 温阳通络方各组p lexinA、Sema3A、NRP-1的表达(±s)

表2 温阳通络方各组p lexinA、Sema3A、NRP-1的表达(±s)

注:与模型组相比,△P<0.05

组别n plexinA Sema3A NRP-1空白组3 0.85±0.06△1.07±0.16△0.94±0.14△模型组3 0.41±0.15 0.64±0.09 0.65±0.05甲氨蝶呤组3 0.77±0.07△1.03±0.17△0.90±0.20△温阳通络方高剂量组3 0.81±0.19△1.02±0.18△0.94±0.08△温阳通络方中剂量组3 0.68±0.04△0.87±0.06 0.92±0.14△温阳通络方低剂量组3 0.61±0.06△0.70±0.04 0.76±0.10

3.2 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A m RNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响与空白组相比,模型组可明显降低PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表达量(P<0.05)。与模型组相比,温阳通络方各剂量组和甲氨蝶呤组可升高PlexinA mRNA、Sema3A mRNA、NRP-1 mRNA的表达量(P<0.05)。见表3。

表3 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响(±s)

表3 温阳通络方对各组PlexinA m RNA、Sema3A mRNA、NRP-1 m RNA表达水平的影响(±s)

注:与模型组相比,△P<0.05

mRNA空白组3 1.00±0.00△1.00±0.00△1.00±0.00组别n PlexinA mRNA Sema3A mRNA NRP-1△模型组3 0.24±0.03 0.23±0.03 0.22±0.03甲氨蝶呤组3 0.84±0.08△0.85±0.07△0.85±0.06△温阳通络方高剂量组3 0.86±0.06△0.86±0.07△0.89±0.05△温阳通络方中剂量组3 0.58±0.09△0.50±0.06△0.50±0.06△温阳通络方低剂量组3 0.30±0.02△0.29±0.04△0.30±0.06△

3.3 滑膜细胞凋亡实验与正常组相比,温阳通络方+LPS组、温阳通络方组滑膜细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与LPS组相比,温阳通络方+LPS组、温阳通络方组滑膜细胞凋亡率明显(P<0.05)。见图2、表4。

图2 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响

表4 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响(±s)

表4 温阳通络方对各组滑膜细胞凋亡率的影响(±s)

注:与正常组相比,*P<0.05,与LPS组相比,△P<0.05

/%LPS组组别n凋亡率1.11±0.06正常组3 2.53±0.12温阳通络方+LPS组3 15.01±0.03*△温阳通络方组3 37.02±1.61 3*△

4 讨论

温阳通络方是国家级名老中医吴生元教授基于“阳虚络痹”理论总结出的治疗类风湿关节炎的效验方。全方由附片、桂枝、麻黄、川芎、薏苡仁、赤芍、五加皮等10味中药组成,具有温阳散寒、祛风除湿、通络止痛之功,主治类风湿关节炎寒湿痹阻证或风寒湿痹证。前期研究证实,温阳通络方具有良好的抗炎、镇痛、免疫调节及抑制骨破坏的作用[2-5]。《中藏经》指出:“阳者生之本,阴者死之基,阴宜长损,阳宜长益,顺阳者生,逆阳者死”“阳化气,阴成形”,阳气流通,阴气无滞,自然百病不作。阳衰阴长,风寒湿乘虚侵袭,具体表现在有形阴邪积聚。因此,阳虚邪乘,络脉痹阻可能是滑膜发生嗜神经侵袭的病机所在。

Sema3A/NRP-1/PlexinA复合体在RA滑膜组织的表达证实了嗜神经侵袭可能是RA发病的重要机制。Sema3A具有免疫调节的作用,它能与血管内皮生长因子165(VEGF165)竞争性结合NRP-1[6-15]。研究显示,Sema3A能完全阻断VEGF165信号通路,因此,其表达减少能加剧RA病程[16-20]。而NRP-1介导的信号转导是由PlexinA共受体实现的。Sema3A/NRP-1/PlexinA复合体通过小G蛋白家族的Rac和Rho实现对细胞微丝骨架的调控。其中,Rac家族与B淋巴细胞增殖激活和树突状细胞介导的T淋巴细胞激活密切相关[21-22]。由此可见,Sema3A/NRP-1/PlexinA调控体系参与了类风湿关节炎病理进程,其对RA的调控可能通过免疫调节及抗滑膜新生血管形成发挥作用。

综上所述,嗜神经侵袭可能参与滑膜增殖,是类风湿关节炎发生发展的重要机制。Sema3A/NRP-1/PlexinA调控体系在滑膜病程中可能有重要作用,其可能通过影响滑膜细胞凋亡等抑制炎症反应发展。Sema3A/NRP-1/PlexinA体系可能是温阳通络方治疗RA的效验靶点。

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